प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप बनाम साधारण प्रकाश माइक्रोस्कोप की तुलना और विशेषताएं
प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी सामान्य प्रकाश सूक्ष्मदर्शी से भिन्न होते हैं। पारंपरिक प्रकाश स्रोत से रोशनी के तहत नमूनों का निरीक्षण करने के बजाय, वे माइक्रोस्कोप पर नमूने के भीतर फ्लोरोसेंट पदार्थों को उत्तेजित करने के लिए एक विशिष्ट तरंग दैर्ध्य (आमतौर पर पराबैंगनी या नीली-बैंगनी प्रकाश) के प्रकाश का उपयोग करते हैं, जिससे वे प्रतिदीप्ति उत्सर्जित करते हैं। इसलिए, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का प्रकाश स्रोत प्रत्यक्ष रोशनी के लिए काम नहीं करता है; यह नमूने में अंतर्जात फ्लोरोसेंट पदार्थों को उत्तेजित करने के लिए एक ऊर्जा स्रोत के रूप में कार्य करता है। हम प्रकाश स्रोत से रोशनी के कारण नहीं, बल्कि नमूने में फ्लोरोसेंट पदार्थों द्वारा उत्तेजना प्रकाश ऊर्जा को अवशोषित करने के बाद उत्पन्न प्रतिदीप्ति घटना के कारण नमूने का निरीक्षण करने में सक्षम हैं।
इससे पता चलता है कि प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप की मुख्य विशेषता यह है कि इसका प्रकाश स्रोत एक निर्दिष्ट तरंग दैर्ध्य सीमा के भीतर प्रचुर उत्तेजना प्रकाश प्रदान करता है, ताकि परीक्षण नमूने में फ्लोरोसेंट पदार्थ पर्याप्त तीव्रता का उत्तेजना प्रकाश प्राप्त कर सकें। इस बीच, एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप को एक उपयुक्त फिल्टर प्रणाली से सुसज्जित किया जाना चाहिए। प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी प्रतिदीप्ति हिस्टोकैमिस्ट्री के लिए एक आवश्यक उपकरण है। इसमें एक अल्ट्रा-हाई-प्रेशर प्रकाश स्रोत, एक फिल्टर सेट (उत्तेजना और बाधा फिल्टर सहित), एक ऑप्टिकल सिस्टम और एक फोटोग्राफिक सिस्टम सहित प्रमुख घटक शामिल हैं। यह प्रतिदीप्ति उत्सर्जन को प्रेरित करने के लिए एक निश्चित तरंग दैर्ध्य के प्रकाश के साथ रोमांचक नमूनों द्वारा काम करता है।
प्रतिदीप्ति उत्तेजना विधियाँ: तरंग दैर्ध्य रेंज द्वारा दो प्रकारों में वर्गीकृत: यूवी उत्तेजना (पराबैंगनी रोशनी विधि) और बीवी उत्तेजना (नीली-बैंगनी प्रकाश विधि)। यूवी उत्तेजना विधि उत्तेजना के लिए 400 एनएम से कम पराबैंगनी प्रकाश का उपयोग करती है। इस विधि में कोई दृश्य उत्तेजना प्रकाश मौजूद नहीं है। नतीजतन, देखी गई प्रतिदीप्ति डाई की अंतर्निहित प्रतिदीप्ति को दर्शाती है, जिससे पृष्ठभूमि ऊतक के ऑटोफ्लोरेसेंस से नमूने पर विशिष्ट प्रतिदीप्ति को अलग करना आसान हो जाता है।
बीवी उत्तेजना विधि: 404 एनएम और 434 एनएम पर केंद्रित पराबैंगनी से नीले रंग तक के प्रकाश का उपयोग करके उत्तेजना की जाती है। चूंकि यह विधि नमूने को नीली रोशनी से विकिरणित करती है, इसलिए प्रतिदीप्ति अवलोकन प्रणाली के कट-ऑफ फिल्टर को आवश्यक हरे और पीले प्रतिदीप्ति को पर्याप्त रूप से संचारित करते हुए नीली रोशनी को पूरी तरह से अवरुद्ध करना होगा। इसे फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी परीक्षण में उपयोग किए जाने वाले फ्लोरोक्रोम पर लागू किया जाता है। उत्तेजना प्रकाश की अधिकतम अवशोषण तरंग दैर्ध्य प्रतिदीप्ति की अधिकतम उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के अपेक्षाकृत करीब है, इसलिए बीवी उत्तेजना विधि के लिए तेज-कट फिल्टर अनिवार्य हैं। इस दृष्टिकोण में नीली रोशनी का उपयोग उत्तेजना प्रकाश के रूप में किया जा सकता है, जो फ्लोरोक्रोम और अपेक्षाकृत उज्ज्वल छवियों की उच्च अवशोषण दक्षता उत्पन्न करता है। इसका नुकसान यह है कि 500 एनएम से नीचे प्रतिदीप्ति का पता नहीं लगाया जा सकता है, जबकि 500 एनएम से ऊपर के सिग्नल पूरी छवि को पीला कर देते हैं। फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी परीक्षण में, विशिष्टता को ज्यादातर फ्लोरोक्रोम के विशिष्ट रंग से आंका जाता है। इसलिए, जब सूक्ष्म विशिष्टता का मूल्यांकन किया जा रहा है, तो बीवी उत्तेजना विधि की कमियां अक्सर महत्वपूर्ण प्रतिकूल प्रभाव डालती हैं।
