दो-फोटॉन प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी क्या है?
दो-फोटॉन उत्तेजना का मूल सिद्धांत है: उच्च फोटॉन घनत्व के मामले में, फ्लोरोसेंट अणु एक ही समय में दो लंबी-तरंग दैर्ध्य फोटॉन को अवशोषित कर सकते हैं, और तथाकथित उत्तेजित अवस्था जीवनकाल की एक छोटी अवधि के बाद एक छोटी-तरंग दैर्ध्य फोटॉन का उत्सर्जन कर सकते हैं। . ; इसका प्रभाव एक फ्लोरोसेंट अणु को उत्तेजित करने के लिए एक फोटॉन का उपयोग करने के समान है जिसकी तरंग दैर्ध्य लंबी तरंग दैर्ध्य का आधा है। दो-फोटॉन उत्तेजना के लिए उच्च फोटॉन घनत्व की आवश्यकता होती है। कोशिकाओं को नुकसान न पहुँचाने के लिए, दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी उच्च-ऊर्जा मोड-लॉक स्पंदित लेजर का उपयोग करती है। इस लेजर द्वारा उत्सर्जित लेजर में उच्च शिखर ऊर्जा और कम औसत ऊर्जा होती है, इसकी पल्स चौड़ाई केवल 100 फेमटोसेकंड होती है, और इसकी आवृत्ति 80 से 100 मेगाहर्ट्ज़ तक पहुंच सकती है। स्पंदित लेजर के फोटॉनों पर ध्यान केंद्रित करने के लिए उच्च संख्यात्मक एपर्चर ऑब्जेक्टिव लेंस का उपयोग करते समय, ऑब्जेक्टिव लेंस के फोकल बिंदु पर फोटॉन घनत्व सबसे अधिक होता है, और दो-फोटॉन उत्तेजना केवल ऑब्जेक्टिव लेंस के फोकल बिंदु पर होती है, इसलिए दो-फोटॉन माइक्रोस्कोप को कन्फोकल पिनहोल की आवश्यकता नहीं होती है, जो प्रतिदीप्ति पहचान दक्षता में सुधार करती है।
सामान्य प्रतिदीप्ति घटना में, उत्तेजना प्रकाश के कम फोटॉन घनत्व के कारण, एक फ्लोरोसेंट अणु एक ही समय में केवल एक फोटॉन को अवशोषित कर सकता है, और फिर एक विकिरण संक्रमण के माध्यम से एक फ्लोरोसेंट फोटॉन उत्सर्जित कर सकता है, जो एकल-फोटॉन प्रतिदीप्ति है। प्रकाश स्रोत के रूप में लेजर का उपयोग करके प्रतिदीप्ति उत्तेजना प्रक्रिया के लिए, दो-फोटॉन या यहां तक कि बहु-फोटॉन प्रतिदीप्ति हो सकती है। इस समय, उपयोग किए जाने वाले उत्तेजना प्रकाश स्रोत की तीव्रता अधिक होती है, और फोटॉन घनत्व एक ही समय में दो फोटॉनों को अवशोषित करने वाले फ्लोरोसेंट अणुओं की आवश्यकताओं को पूरा करता है। उत्तेजना प्रकाश स्रोत के रूप में एक सामान्य लेजर का उपयोग करने की प्रक्रिया में, फोटॉन घनत्व अभी भी दो-फोटॉन अवशोषण घटना उत्पन्न करने के लिए पर्याप्त नहीं है। आमतौर पर, एक फेमटोसेकंड स्पंदित लेजर का उपयोग किया जाता है, और इसकी तात्कालिक शक्ति मेगावाट के क्रम तक पहुंच सकती है। इसलिए, दो-फोटॉन प्रतिदीप्ति की तरंग दैर्ध्य उत्तेजना प्रकाश की तरंग दैर्ध्य से कम है, जो उत्तेजना तरंग दैर्ध्य के आधे पर उत्तेजना द्वारा उत्पन्न प्रभाव के बराबर है।
