कॉन्फोकल फ्लोरोसेंस माइक्रोस्कोपी को समझना
कंफोकल फ्लोरोसेंस माइक्रोस्कोपी का मूल सिद्धांत: नमूने को रोशन करने के लिए एक बिंदु प्रकाश स्रोत का उपयोग करें ताकि फोकल प्लेन पर एक छोटा, अच्छी तरह से परिभाषित प्रकाश स्थान बनाया जा सके। स्पॉट द्वारा प्रकाशित होने के बाद उत्सर्जित फ्लोरोसेंस को ऑब्जेक्टिव लेंस द्वारा एकत्र किया जाता है और मूल रोशनी प्रकाश पथ के साथ डाइक्रोइक दर्पण में वापस कर दिया जाता है। एक बीम स्प्लिटर का गठन करें। स्पेक्ट्रोमीटर फ्लोरोसेंस को सीधे डिटेक्टर को भेजता है। प्रकाश स्रोत और डिटेक्टर के सामने एक पिनहोल होता है, जिसे क्रमशः रोशनी पिनहोल और डिटेक्शन पिनहोल कहा जाता है। दोनों के ज्यामितीय आयाम सुसंगत हैं, लगभग 100-200nm; फोकल प्लेन पर प्रकाश बिंदु के सापेक्ष, दोनों संयुग्मित हैं, अर्थात, प्रकाश बिंदु लेंस की एक श्रृंखला से गुजरता है और अंततः एक ही समय में रोशनी पिनहोल और डिटेक्शन पिनहोल पर केंद्रित हो सकता है। इस तरह, फोकल प्लेन से प्रकाश को डिटेक्शन होल की सीमा के भीतर केंद्रित किया जा सकता है, जबकि फोकल प्लेन के ऊपर या नीचे से बिखरा हुआ प्रकाश डिटेक्शन होल के बाहर अवरुद्ध हो जाता है और उसकी छवि नहीं बनाई जा सकती है। नमूने को लेजर से बिंदुवार स्कैन किया जाता है, तथा डिटेक्शन पिनहोल के पीछे स्थित फोटोमल्टीप्लायर ट्यूब भी संबंधित प्रकाश बिंदु की बिंदुवार कन्फोकल छवि प्राप्त करता है, जिसे डिजिटल सिग्नल में परिवर्तित कर कंप्यूटर को प्रेषित किया जाता है, तथा अंत में स्क्रीन पर संपूर्ण फोकल प्लेन की स्पष्ट कन्फोकल छवि में एकत्रित किया जाता है।
प्रत्येक फोकल प्लेन इमेज वास्तव में नमूने का एक ऑप्टिकल क्रॉस-सेक्शन है। इस ऑप्टिकल क्रॉस-सेक्शन में हमेशा एक निश्चित मोटाई होती है और इसे ऑप्टिकल थिन सेक्शन भी कहा जाता है। चूंकि फोकस पर प्रकाश की तीव्रता गैर-फोकस पर प्रकाश की तीव्रता से बहुत अधिक होती है, और गैर-फोकल प्लेन प्रकाश को पिनहोल द्वारा फ़िल्टर किया जाता है, कॉन्फोकल सिस्टम के क्षेत्र की गहराई लगभग शून्य होती है। Z-अक्ष दिशा के साथ स्कैनिंग ऑप्टिकल टोमोग्राफी का एहसास कर सकती है, जिससे वांछित बन सकता है नमूने के केंद्रित स्थान पर दो आयामी ऑप्टिकल सेक्शन का निरीक्षण करें। XY प्लेन (फोकल प्लेन) स्कैनिंग को Z-अक्ष (ऑप्टिकल अक्ष) स्कैनिंग के साथ जोड़कर, दो आयामी छवियों के निरंतर स्तरों को जमा करके और उन्हें विशेष कंप्यूटर सॉफ्टवेयर के साथ संसाधित करके, नमूने की एक त्रि-आयामी छवि प्राप्त की जा सकती है।
अर्थात्, संसूचन पिनहोल और प्रकाश स्रोत पिनहोल हमेशा एक ही बिंदु पर केंद्रित होते हैं, ताकि फोकस तल के बाहर उत्तेजित प्रतिदीप्ति संसूचन पिनहोल में प्रवेश न कर सके।
लेजर कन्फोकल के कार्य सिद्धांत की सरल अभिव्यक्ति यह है कि यह प्रकाश स्रोत के रूप में लेजर का उपयोग करता है। पारंपरिक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप इमेजिंग के आधार पर, एक लेजर स्कैनिंग डिवाइस और एक संयुग्मित फ़ोकसिंग डिवाइस को जोड़ा जाता है, और सिस्टम को डिजिटल छवियों को इकट्ठा करने और संसाधित करने के लिए कंप्यूटर द्वारा नियंत्रित किया जाता है।
