ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप की मुख्य अवलोकन विधि प्रतिदीप्ति अवलोकन है

ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप की मुख्य अवलोकन विधि प्रतिदीप्ति अवलोकन है

प्रतिदीप्ति घटना

प्रतिदीप्ति उस प्रक्रिया को संदर्भित करता है जिसमें एक फ्लोरोसेंट पदार्थ एक विशिष्ट तरंग दैर्ध्य (चित्रा 1) के प्रकाश के साथ विकिरणित होने पर लगभग एक साथ लंबी तरंग दैर्ध्य के साथ प्रकाश का उत्सर्जन करता है। जब एक विशिष्ट तरंग दैर्ध्य (उत्तेजना तरंग दैर्ध्य) का प्रकाश एक अणु (जैसे फ्लोरोफोर में एक अणु) पर हमला करता है, तो अणु के इलेक्ट्रॉनों द्वारा फोटॉन ऊर्जा को अवशोषित किया जाता है। इसके बाद, इलेक्ट्रॉन जमीनी अवस्था (S0) से एक उच्च ऊर्जा स्तर, उत्तेजित अवस्था (S1') में संक्रमण करते हैं। इस प्रक्रिया को उत्तेजना① कहा जाता है। इलेक्ट्रॉन 10-9–10-8 सेकंड के लिए उत्तेजित अवस्था में रहता है, इस दौरान इलेक्ट्रॉन कुछ ऊर्जा ② खो देता है। उत्तेजित अवस्था (S1) को छोड़ने और जमीनी अवस्था में लौटने की प्रक्रिया में ③, उत्तेजना प्रक्रिया के दौरान अवशोषित शेष ऊर्जा निकल जाएगी।

उत्तेजित अवस्था में एक फ्लोरोसेंट अणु का निवास समय आमतौर पर नैनोसेकंड में प्रतिदीप्ति जीवनकाल होता है, जो कि फ्लोरोसेंट अणु की एक अंतर्निहित विशेषता है। प्रतिदीप्ति जीवनकाल का उपयोग करने वाली इमेजिंग की तकनीक को फ्लोरेसेंस लाइफटाइम इमेजिंग (एफएलआईएम) कहा जाता है, जो आणविक रचना, इंटरमॉलिक्युलर इंटरैक्शन और आणविक सूक्ष्म वातावरण प्राप्त करने के लिए प्रतिदीप्ति तीव्रता इमेजिंग के अलावा अधिक गहराई से कार्यात्मक और सटीक माप कर सकती है। जानकारी जो पारंपरिक ऑप्टिकल इमेजिंग के साथ प्राप्त करना मुश्किल है।

फ्लोरेसेंस की एक अन्य महत्वपूर्ण संपत्ति स्टोक्स शिफ्ट है, उत्तेजना और उत्सर्जन चोटियों (चित्रा 2) के बीच तरंग दैर्ध्य में अंतर। आमतौर पर उत्सर्जन प्रकाश तरंग दैर्ध्य उत्तेजना प्रकाश तरंग दैर्ध्य से अधिक लंबा होता है। ऐसा इसलिए है क्योंकि फ्लोरोसेंट पदार्थ उत्तेजित होने के बाद और फोटॉन जारी होने से पहले, विश्राम प्रक्रिया के माध्यम से इलेक्ट्रॉन ऊर्जा का एक हिस्सा खो देंगे। बड़े स्टोक्स बदलाव वाले फ्लोरोसेंट पदार्थ फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के तहत निरीक्षण करना आसान होता है।

प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी और प्रतिदीप्ति फ़िल्टर ब्लॉक

प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप है जो अवलोकन और छवि के लिए प्रतिदीप्ति गुणों का उपयोग करता है, और व्यापक रूप से कोशिका जीव विज्ञान, तंत्रिका जीव विज्ञान, वनस्पति विज्ञान, सूक्ष्म जीव विज्ञान, विकृति विज्ञान, आनुवंशिकी और अन्य क्षेत्रों में उपयोग किया जाता है। प्रतिदीप्ति इमेजिंग में उच्च संवेदनशीलता और उच्च विशिष्टता के फायदे हैं, और ऊतकों और कोशिकाओं में विशिष्ट प्रोटीन, ऑर्गेनेल आदि के वितरण के अवलोकन के लिए बहुत उपयुक्त है, सह-स्थानीयकरण और बातचीत का अध्ययन, और जीवन गतिशील की ट्रैकिंग आयन सांद्रता में परिवर्तन जैसी प्रक्रियाएं।

कोशिकाओं में अधिकांश अणु प्रतिदीप्त नहीं होते हैं, और उन्हें देखने के लिए, उन्हें प्रतिदीप्त रूप से लेबल किया जाना चाहिए। फ्लोरोसेंट लेबलिंग के कई तरीके हैं, जिन्हें सीधे लेबल किया जा सकता है (जैसे डीएनए को लेबल करने के लिए डीएपीआई का उपयोग करना), या एंटीबॉडी के एंटीजन-बाइंडिंग गुणों का उपयोग करके इम्यूनोस्टेनिंग, या लक्षित प्रोटीन को फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जैसे जीएफपी, ग्रीन) के साथ लेबल किया जा सकता है। फ्लोरोसेंट प्रोटीन), या प्रतिवर्ती बंधन। सिंथेटिक रंजक (जैसे फुरा -2), आदि।

वर्तमान में, प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी विभिन्न प्रयोगशालाओं और इमेजिंग प्लेटफार्मों के मानक इमेजिंग उपकरण बन गए हैं, और यह हमारे दैनिक प्रयोगों के लिए एक अच्छा सहायक है। प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी को मुख्य रूप से तीन श्रेणियों में विभाजित किया जाता है: ईमानदार प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी (सेक्शनिंग के लिए उपयुक्त), उल्टे प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी (जीवित कोशिकाओं के लिए उपयुक्त, अनुभागों को ध्यान में रखते हुए), फ्लोरोसेंट त्रिविम सूक्ष्मदर्शी (बड़े नमूनों के लिए उपयुक्त, जैसे पौधे, ज़ेब्राफिश (वयस्क /) भ्रूण), मेदका, माउस/चूहे के अंग, आदि)।

प्रतिदीप्ति फिल्टर ब्लॉक सूक्ष्मदर्शी में प्रतिदीप्ति इमेजिंग का मुख्य घटक है। इसमें एक एक्साइटमेंट फिल्टर, एक एमिशन फिल्टर और एक डाइक्रोइक बीम स्प्लिटर होता है। इसे फ़िल्टर व्हील में स्थापित किया गया है, जैसे कि Leica DMi8 एक 6-पोजिशन फ़िल्टर व्हील (चित्र 3) से सुसज्जित है। ). अलग-अलग सूक्ष्मदर्शी में अलग-अलग पहिये की स्थिति होती है, और कुछ सूक्ष्मदर्शी फिल्टर स्लाइड का उपयोग करते हैं।

फ़िल्टर ब्लॉक प्रतिदीप्ति इमेजिंग में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है: उत्तेजना फ़िल्टर नमूना को उत्तेजित करने के लिए उत्तेजना प्रकाश का चयन करता है और प्रकाश के अन्य तरंग दैर्ध्य को अवरुद्ध करता है; उत्तेजना फ़िल्टर के माध्यम से गुजरने वाली रोशनी एक डाइक्रोइक बीमप्लिटर से गुज़रती है (इसकी भूमिका उत्तेजना प्रकाश को प्रतिबिंबित करने और फ्लोरोसेंस संचारित करने के लिए होती है), प्रतिबिंब के बाद, यह उद्देश्य लेंस द्वारा केंद्रित होता है, नमूना के लिए विकिरणित होता है, और संबंधित फ्लोरोसेंस उत्तेजित होता है प्रकाश फेंको। उत्सर्जित प्रकाश वस्तुनिष्ठ लेंस द्वारा एकत्र किया जाता है, डाइक्रोइक बीम स्प्लिटर से होकर गुजरता है, और उत्सर्जन फिल्टर तक पहुंचता है। जैसा कि चित्र 4 में दिखाया गया है: उत्तेजना तरंग दैर्ध्य 450-490 एनएम है, डाइक्रोइक बीम स्प्लिटर 510 एनएम से कम प्रकाश को दर्शाता है, 510 एनएम से अधिक प्रकाश को प्रसारित करता है, और उत्सर्जन प्रकाश प्राप्त करने की सीमा 520-560 एनएम है।

आमतौर पर प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी में उपयोग किए जाने वाले प्रतिदीप्ति फिल्टर को दो प्रकारों में विभाजित किया जा सकता है: लॉन्ग पास (लघु के लिए एलपी) और बैंड पास (लघु के लिए बीपी)। बैंडपास आमतौर पर केंद्रीय तरंग दैर्ध्य और अंतराल की चौड़ाई से निर्धारित होता है, जैसे कि 480/40, जिसका अर्थ है कि 460-500एनएम से प्रकाश पारित किया जा सकता है। लॉन्गपास फिल्टर, जैसे 515 एलपी, 515 एनएम (चित्र 5) से अधिक तरंग दैर्ध्य के साथ प्रकाश पास करते हैं।

फ्लोरोसेंट पदार्थों में उनकी विशिष्ट उत्तेजना (अवशोषण) वक्र और उत्सर्जन वक्र होता है, उत्तेजना शिखर आदर्श उत्तेजना तरंग दैर्ध्य (उच्च उत्तेजना दक्षता, जो उत्तेजना प्रकाश ऊर्जा को कम कर सकता है, कोशिकाओं और रंगों की रक्षा कर सकता है), और उत्सर्जन वक्र उत्सर्जन प्रतिदीप्ति तरंगदैर्ध्य है सीमा। इसलिए, प्रयोग में, हम उत्तेजन के लिए जितना संभव हो उत्तेजन शिखर के करीब तरंगदैर्घ्य का चयन करेंगे, और प्राप्त सीमा में उत्सर्जन शिखर को शामिल करने की आवश्यकता है। उदाहरण के लिए, एलेक्सा फ्लोर 488 का उत्तेजना शिखर 500nm है, और 480/40 का उत्तेजना फ़िल्टर प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप में चुना जा सकता है।

फिल्टर क्यूब्स का विवरण माइक्रोस्कोप इमेजिंग सॉफ्टवेयर में देखा जा सकता है। रंगों को समझना और उस फिल्टर को खोजना जो आपके नमूने से सबसे अच्छा मेल खाता है, प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए महत्वपूर्ण है। फ्लोरोसेंट रंजक और फ्लोरोसेंट प्रोटीन की वर्णक्रमीय जानकारी आमतौर पर निर्देशों में इंगित की जाती है, और इसे ऑनलाइन भी पाया जा सकता है।

फ्लोरोसेंट जांच के उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के अलावा, फ़िल्टर ब्लॉकों के चयन पर भी विचार करने की आवश्यकता है कि क्या गैर-विशिष्ट उत्तेजना है और क्या बहुरंगा लेबल वाले नमूनों के लिए क्रॉस रंग है। इसके अलावा, उपयोग किए जाने वाले फ्लोरोसेंट प्रकाश स्रोत पर विचार करना आवश्यक है। वर्तमान में, आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले फ्लोरोसेंट प्रकाश स्रोतों में पारा लैंप, मेटल हलाइड लैंप और एलईडी प्रकाश स्रोत शामिल हैं जो हाल के वर्षों में तेजी से विकसित हुए हैं। एक फ्लोरोसेंट प्रकाश स्रोत का स्पेक्ट्रम निरंतर या असंतुलित है, और विभिन्न तरंग दैर्ध्य बैंड में ऊर्जा भिन्न होगी। एलईडी प्रकाश स्रोत धीरे-धीरे अपने अपेक्षाकृत संकीर्ण वर्णक्रमीय बैंड, अधिक स्थिर ऊर्जा उत्पादन, लंबे जीवन, सुरक्षित और पर्यावरण संरक्षण और कई अन्य लाभों के कारण प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का मुख्य प्रकाश स्रोत बन रहा है।

माइक्रोस्कोप के बिल्ट-इन फिल्टर ब्लॉक के अलावा, एक बाहरी फास्ट व्हील (चित्र 7) भी है। लीका के बाहरी फास्ट व्हील से सटे फिल्टर की रूपांतरण गति 27ms है, जो FRET और Fura2 अनुपात कैल्शियम इमेजिंग जैसे उच्च गति वाले बहु-रंग प्रयोगों को महसूस कर सकती है। (अंजीर। 8) एट अल।

प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी इमेजिंग तकनीकों की एक विस्तृत विविधता

विभिन्न प्रतिदीप्ति इमेजिंग आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए, प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी के अलावा, विभिन्न प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी इमेजिंग समाधान विकसित किए गए हैं:

लीका थंडर इमेजर जैसे वाइड-फील्ड हाई-डेफिनिशन इमेजिंग सिस्टम, इमेजिंग के दौरान गैर-फोकल विमान हस्तक्षेप संकेतों को कुशलता से हटाने के लिए लीका की अभिनव समाशोधन तकनीक का उपयोग करते हैं, स्पष्ट छवियां पेश करते हैं और उच्च गति इमेजिंग के फायदे पेश करते हैं;

कन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप गैर-फोकल विमान हस्तक्षेप को खत्म करने के लिए पिनहोल का उपयोग करता है, ऑप्टिकल सेक्शनिंग का एहसास करता है, और उच्च-परिभाषा छवियां और त्रि-आयामी छवियां प्राप्त करता है;

अति-उच्च-रिज़ॉल्यूशन सूक्ष्मदर्शी और नैनो-सूक्ष्मदर्शी जो विवर्तन सीमा को तोड़ते हैं, 200 एनएम से छोटी सूक्ष्म संरचनाओं का निरीक्षण कर सकते हैं;

थिक टिश्यू और डीप इन वीवो की इमेजिंग के लिए मल्टीफोटोन एक्साइटेशन के सिद्धांत का उपयोग करते हुए एक मल्टीफोटोन इमेजिंग सिस्टम;

उच्च अस्थायी और स्थानिक संकल्प, तेज इमेजिंग गति, उच्च संकल्प, कम फोटोटॉक्सिसिटी के साथ लाइट शीट इमेजिंग तकनीक, विशेष रूप से विकास और विवो गतिशील अवलोकन में अनुसंधान के लिए उपयुक्त;

फ्लोरेसेंस लाइफटाइम इमेजिंग (एफएलआईएम), जो फ्लोरोसेंट पदार्थ एकाग्रता, फोटोब्लीचिंग, उत्तेजना प्रकाश तीव्रता इत्यादि जैसे कारकों से प्रभावित नहीं है, अधिक गहराई से कार्यात्मक और सटीक माप कर सकता है;

प्रतिदीप्ति सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (FCS) और प्रतिदीप्ति क्रॉस सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (FCCS), आणविक संख्या और फ्लोरोसेंट अणुओं के प्रसार गुणांक को मापते हैं, जिससे आणविक एकाग्रता, आणविक आकार, चिपचिपाहट, आणविक गति, आणविक बंधन / पृथक्करण और आणविक ऑप्टिकल गुणों का विश्लेषण होता है;

टोटल इंटरनल रिफ्लेक्शन फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी (टीआईआरएफ), अत्यंत उच्च z-अक्ष विभेदन के साथ, कोशिका झिल्ली सतहों की आणविक संरचना और गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए आदर्श है।