लेजर कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी (एलएससीएम) के सिद्धांत
लेजर कन्फोकल माइक्रोस्कोप प्रकाश स्रोत के पीछे रखे गए एक रोशनी पिनहोल और डिटेक्टर के सामने रखे गए एक डिटेक्शन पिनहोल का उपयोग करता है ताकि बिंदु रोशनी और बिंदु पहचान प्राप्त की जा सके। प्रकाश स्रोत से प्रकाश रोशनी पिनहोल के माध्यम से उत्सर्जित प्रकाश द्वारा नमूने के फोकल प्लेन में एक बिंदु पर केंद्रित होता है, और उस बिंदु से उत्सर्जित प्रतिदीप्ति का पता लगाने वाले पिनहोल के भीतर चित्रण किया जाता है, और उस बिंदु के बाहर उत्सर्जित किसी भी प्रकाश को डिटेक्शन पिनहोल द्वारा अवरुद्ध किया जाता है। रोशनी पिनहोल और डिटेक्शन पिनहोल प्रबुद्ध या पता लगाए गए बिंदु के लिए संयुग्मित होते हैं, ताकि पता लगाया गया बिंदु कन्फोकल बिंदु हो और वह तल जहाँ पता लगाया गया बिंदु स्थित है वह कन्फोकल तल है। कंप्यूटर एक छवि बिंदु के रूप में कंप्यूटर स्क्रीन पर पता लगाए गए बिंदु को प्रदर्शित करता है। एक पूर्ण छवि बनाने के लिए, ऑप्टिकल पथ में एक स्कैनिंग सिस्टम नमूने के फोकल तल पर स्कैन करता है, इस प्रकार एक पूर्ण कन्फोकल छवि बनाता है। जब तक वाहक चरण को Z-अक्ष के साथ ऊपर-नीचे घुमाया जाता है, तब तक नमूने का एक नया स्तर कोन्फोकल तल पर ले जाया जाता है, और नमूने के नए स्तर का चित्र मॉनीटर पर लिया जाता है, जब Z-अक्ष घूमना जारी रखता है, तो नमूने के विभिन्न स्तरों के क्रमिक प्रकाश-कट चित्र प्राप्त होते हैं।
पारंपरिक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप एक क्षेत्र प्रकाश स्रोत का उपयोग करता है, नमूने पर प्रत्येक बिंदु की छवि पड़ोसी बिंदुओं से प्रकाश के विवर्तन या बिखराव से बाधित होगी; लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप आंतरिक फोकल प्लेन के प्रत्येक बिंदु पर स्कैन किए गए नमूने पर एक बिंदु प्रकाश स्रोत बनाने के लिए प्रबुद्ध पिनहोल के माध्यम से एक लेजर बीम का उपयोग करता है, विकिरणित बिंदु पर नमूना, पता लगाने वाले पिनहोल की इमेजिंग, प्रकाश गुणन ट्यूब (पीएमटी) या ठंडे इलेक्ट्रोकपल्ड डिवाइस (सीसीसीडी) के बिंदु के बाद पिनहोल का पता लगाने से बिंदु-दर-बिंदु या लाइन-दर-लाइन प्राप्त होता है, एक फ्लोरोसेंट छवि कंप्यूटर मॉनीटर स्क्रीन पर तेजी से बनती है। रोशनी पिनहोल और पता लगाने पिनहोल उद्देश्य लेंस के फोकल विमान के सापेक्ष संयुग्म है, एक ही समय में फोकल विमान पर बिंदु रोशनी पिनहोल और उत्सर्जन पिनहोल पर केंद्रित है, फोकल विमान के बाहर बिंदु इमेजिंग पर पिनहोल का पता लगाने में नहीं होगा, ताकि प्राप्त confocal छवि नमूना के ऑप्टिकल पार अनुभाग है, साधारण माइक्रोस्कोप छवि फजी की कमियों पर काबू पाने।
मूल सिद्धांत से, लेजर कन्फोकल माइक्रोस्कोप एक आधुनिक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप है, यह निम्नलिखित सुधार करने के लिए प्रौद्योगिकी से साधारण प्रकाश माइक्रोस्कोप है।
1. प्रकाश स्रोत के रूप में लेजर का उपयोग करें क्योंकि लेजर की मोनोक्रोमैटिकिटी बहुत अच्छी है, प्रकाश स्रोत बीम की तरंग दैर्ध्य समान है, जो मूल रूप से रंगीन विपथन को समाप्त करती है।
2. कन्फोकल प्रौद्योगिकी का उपयोग करके ऑब्जेक्टिव लेंस के फोकल प्लेन को बीच में रखा जाता है तथा बैफल में एक छोटा सा छेद किया जाता है, जिससे फोकल प्लेन बाहर की ओर होता है तथा आवारा प्रकाश अवरुद्ध हो जाता है, जिससे गोलाकार विपथन समाप्त हो जाता है; तथा आगे चलकर रंगीन विपथन भी समाप्त हो जाता है।
3. लेजर कन्फोकल माइक्रोस्कोप बिंदु स्कैनिंग तकनीक का उपयोग करके नमूने को दो-आयामी या तीन-आयामी अंतरिक्ष में अनगिनत बिंदुओं में विघटित करता है, एक बहुत ही छोटे लेजर बीम (बिंदु प्रकाश स्रोत) के साथ बिंदु से बिंदु, रेखा से रेखा स्कैनिंग इमेजिंग, और फिर एक पूरे विमान या तीन-आयामी छवि के माइक्रो कंप्यूटर संयोजन के माध्यम से। पारंपरिक प्रकाश माइक्रोस्कोप एक बार की इमेजिंग के तहत एक क्षेत्र प्रकाश स्रोत है, छवि के प्रत्येक बिंदु पर नमूने विवर्तित प्रकाश और बिखरे हुए प्रकाश हस्तक्षेप के बिंदु से सटे होंगे। इन दो छवियों की स्पष्टता और सटीकता की तुलना नहीं की जा सकती।
4. कंप्यूटर द्वारा ऑप्टिकल सिग्नल का अधिग्रहण और प्रसंस्करण तथा फोटोमल्टीप्लायर ट्यूब द्वारा सिग्नल का प्रवर्धन
लेजर कन्फोकल माइक्रोस्कोप में, अवलोकन और वीडियो रिकॉर्डिंग के लिए कंप्यूटर मानव आँख या कैमरे की जगह लेता है, और प्राप्त छवियों को डिजिटल किया जाता है और छवियों की स्पष्टता को फिर से सुधारने के लिए कंप्यूटर में संसाधित किया जा सकता है। इसके अलावा, फोटोमल्टीप्लायर ट्यूबों का उपयोग बहुत कमजोर संकेतों को बढ़ा सकता है, जिससे संवेदनशीलता में काफी सुधार होता है। उपरोक्त तकनीकों के संयुक्त उपयोग के परिणामस्वरूप, यह कहा जा सकता है कि LSCM दुनिया का सबसे उन्नत माइक्रोस्कोप है। यह कहा जा सकता है कि LSCM माइक्रोस्कोप उत्पादन तकनीक, फोटोइलेक्ट्रिक तकनीक, कंप्यूटर तकनीक ** का संयोजन है, जो आधुनिक तकनीक के विकास का अपरिहार्य उत्पाद है।
