प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी के सिद्धांत और संरचनात्मक विशेषताएं
प्रतिदीप्ति प्रकाश स्रोत आम तौर पर एक अति-उच्च दबाव पारा लैंप (50-200 डब्ल्यू) का उपयोग करता है, जो विभिन्न तरंग दैर्ध्य का प्रकाश उत्सर्जित करता है। हालाँकि, प्रत्येक फ्लोरोसेंट पदार्थ में एक विशिष्ट उत्तेजना तरंगदैर्घ्य होता है जो तीव्र प्रतिदीप्ति उत्पन्न करता है। इस कारण से, एक उत्तेजना फिल्टर (आमतौर पर पराबैंगनी, बैंगनी, नीले और हरे प्रकार में उपलब्ध) की आवश्यकता होती है जो केवल एक विशिष्ट तरंग दैर्ध्य के उत्तेजना प्रकाश को गुजरने और नमूने को विकिरणित करने की अनुमति देता है, जबकि अन्य सभी तरंग दैर्ध्य को अवशोषित करता है।
जब उत्तेजना प्रकाश द्वारा विकिरणित किया जाता है, तो प्रत्येक पदार्थ अत्यंत कम समय के भीतर उत्तेजना प्रकाश की तुलना में लंबी तरंग दैर्ध्य के साथ दृश्यमान प्रतिदीप्ति उत्सर्जित करता है। प्रतिदीप्ति अत्यधिक विशिष्ट होती है और आमतौर पर उत्तेजना प्रकाश की तुलना में कमजोर होती है। इस विशिष्ट प्रतिदीप्ति का निरीक्षण करने के लिए, ऑब्जेक्टिव लेंस के पीछे एक अवरोध (या दमन) फ़िल्टर स्थापित किया जाना चाहिए। यह दो उद्देश्यों को पूरा करता है: पहला, यह प्रतिदीप्ति अवलोकन में हस्तक्षेप करने और आंखों को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए उत्तेजना प्रकाश को ऐपिस में प्रवेश करने से रोकता है और रोकता है; दूसरा, यह एक विशिष्ट फ्लोरोसेंट रंग उत्पन्न करने के लिए विशिष्ट प्रतिदीप्ति को चुनिंदा रूप से प्रसारित करता है। दो प्रकार के फ़िल्टर का चयन किया जाना चाहिए और मिलान जोड़े में उपयोग किया जाना चाहिए।
प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी को उनके ऑप्टिकल पथ के आधार पर दो प्रकारों में विभाजित किया जाता है:
1. संचारित-प्रकाश प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप
इस डिज़ाइन में, उत्तेजना प्रकाश स्रोत प्रतिदीप्ति को उत्तेजित करने के लिए कंडेनसर और नमूना सामग्री से होकर गुजरता है। आमतौर पर डार्क-फील्ड कंडेनसर का उपयोग किया जाता है, हालांकि एक मानक कंडेनसर भी लगाया जा सकता है; परावर्तक दर्पण को नमूने पर उत्तेजना प्रकाश को पुनर्निर्देशित और पार्श्व-विकिरणित करने के लिए समायोजित किया जाता है। यह अपेक्षाकृत पुराने प्रकार का प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी है। इसका लाभ कम आवर्धन पर मजबूत प्रतिदीप्ति है, जबकि इसका नुकसान यह है कि आवर्धन बढ़ने पर प्रतिदीप्ति तीव्रता कम हो जाती है। इसलिए यह बड़े नमूना सामग्रियों के अवलोकन के लिए बेहतर उपयुक्त है।
2. एपिफ़्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप
यह एक आधुनिक, नव विकसित प्रकार का प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी है। संचरित-प्रकाश डिज़ाइन के विपरीत, उत्तेजना प्रकाश को वस्तुनिष्ठ लेंस के माध्यम से नमूना सतह पर नीचे की ओर प्रक्षेपित किया जाता है - एक ही वस्तुनिष्ठ लेंस रोशनी कंडेनसर और प्रतिदीप्ति-संग्रह उद्देश्य दोनों के रूप में कार्य करता है। ऑप्टिकल पथ में ऑप्टिकल अक्ष से 45 डिग्री के कोण पर एक डाइक्रोइक बीमस्प्लिटर स्थापित किया जाता है। उत्तेजना प्रकाश वस्तुनिष्ठ लेंस में परावर्तित होता है और नमूने पर केंद्रित होता है। नमूने द्वारा उत्पन्न प्रतिदीप्ति, वस्तुनिष्ठ लेंस और कवरस्लिप की सतहों से परावर्तित उत्तेजना प्रकाश के साथ, एक साथ वस्तुनिष्ठ लेंस में प्रवेश करती है और डाइक्रोइक बीमस्प्लिटर पर लौटती है, जो उत्तेजना प्रकाश को प्रतिदीप्ति से अलग करती है। शेष उत्तेजना प्रकाश को बैरियर फिल्टर द्वारा अवशोषित कर लिया जाता है।
उत्तेजना फिल्टर, डाइक्रोइक बीमस्प्लिटर और बैरियर फिल्टर के विभिन्न संयोजनों के साथ फिल्टर ब्लॉकों की अदला-बदली करके, विभिन्न फ्लोरोसेंट प्रतिक्रिया उत्पादों की आवश्यकताओं को पूरा किया जा सकता है। इस प्रकार के प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के फायदों में समान क्षेत्र रोशनी, तेज इमेजिंग और उच्च आवर्धन पर प्रतिदीप्ति तीव्रता बढ़ाना शामिल है।
