माइक्रोस्कोपिक इमेजिंग क्लासरूम丨वाइडफील्ड फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप
लाइव सेल इमेजिंग अनुप्रयोगों में, वाइडफील्ड प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी माइक्रोस्कोप चरण पर रखे गए विशिष्ट पर्यावरणीय कक्षों में विकसित आसन्न कोशिकाओं की गतिशीलता के अवलोकन की सुविधा प्रदान करती है। इसके सबसे बुनियादी विन्यास में, ईपीआई प्रतिदीप्ति रोशनी से सुसज्जित एक मानक उलटा टिशू कल्चर माइक्रोस्कोप एक क्षेत्र सरणी डिटेक्टर प्रणाली (आमतौर पर एक सीसीडी कैमरा), उपयुक्त प्रतिदीप्ति फिल्टर और हानिकारक उत्तेजना प्रकाश में कोशिकाओं के अत्यधिक जोखिम को सीमित करने के लिए एक शटर प्रणाली के साथ जोड़ा जाता है। . बुनियादी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी रोशनी और उत्सर्जित प्रकाश का पता लगाने के लिए विशिष्ट बैंडविड्थ का चयन करने के लिए सावधानीपूर्वक मिलान किए गए हस्तक्षेप फिल्टर पर निर्भर करती है। प्रकाश स्रोतों में पारा, क्सीनन, और मेटल हैलाइड आर्क लैंप, बीम विस्तार करने वाले लेजर सिस्टम और प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एलईडी) शामिल हैं, जिनमें से सभी को अलग-अलग फ़िल्टर विनिर्देशों की आवश्यकता होती है। प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी में उपयोग किए जाने वाले सिंथेटिक फ्लोरोफोरस में उत्सर्जन स्पेक्ट्रा होता है जो निकट-पराबैंगनी, दृश्यमान और निकट-अवरक्त क्षेत्रों को कवर करता है। आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड फ्लोरोसेंट प्रोटीन के उपयोग ने लाइव-सेल इमेजिंग में फ्लोरोसेंस माइक्रोस्कोपी की क्षमताओं का काफी विस्तार किया है, जिससे शोधकर्ताओं को रुचि के उपसेलुलर क्षेत्रों को सटीक रूप से लक्षित करने की अनुमति मिलती है।
नुओहाई एलएस 18, नुओहाई द्वारा स्वतंत्र रूप से विकसित एक नए प्रकार का प्रकाश-शीट रोशनी माइक्रोस्कोप, विशेष रूप से पारदर्शी बड़े ऊतक नमूनों की उच्च-रिज़ॉल्यूशन 3 डी इमेजिंग के लिए डिज़ाइन किया गया है, और मस्तिष्क, प्लीहा, छोटी आंत जैसे विभिन्न अक्षुण्ण ऊतकों की खोज के लिए समर्पित है। , किडनी, फेफड़े, हृदय और ट्यूमर। अंगों की 3डी सटीक संरचना।
वाइडफील्ड प्रतिदीप्ति में, माइक्रोस्कोप उद्देश्य द्वारा एकत्र किया गया पूर्ण-एपर्चर उत्सर्जन आवश्यक एक्सपोज़र समय को कम करते हुए रिकॉर्ड किए गए सिग्नल को अधिकतम करता है। इस प्रकार, नमूनों को बहुत कम प्रकाश अवधि के साथ चित्रित किया जा सकता है। वाइडफील्ड इमेजिंग का मुख्य नुकसान यह है कि फोकल प्लेन से दूर के क्षेत्रों से प्रतिदीप्ति, साथ ही पृष्ठभूमि सिग्नल, अवांछित प्रकाश है जो अक्सर रुचि की विशेषताओं को अस्पष्ट करता है। इसलिए, वाइडफ़ील्ड इमेजिंग सबसे अच्छे परिणाम देती है जब रुचि की विशेषताएं बड़ी होती हैं (जैसे ऑर्गेनेल) या प्रकृति में अत्यधिक छिद्रित होती हैं। अनुवर्ती कोशिकाओं, बैक्टीरिया, खमीर और बहुत पतले ऊतक वर्गों सहित जीवित कोशिका नमूनों की एक विस्तृत विविधता, वाइडफील्ड प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए आदर्श उम्मीदवार हैं, हालांकि, अधिक उन्नत विधि इमेजिंग के साथ मोटे ऊतकों (5 माइक्रोन से अधिक) का सबसे अच्छा उपयोग किया जाता है।
यद्यपि सिंथेटिक फ्लोरोसेंट रंगों, क्वांटम डॉट्स और फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ फ्लोरोसेंट इमेजिंग में कई प्रगति हुई है, कुछ मामलों में यह अन्य इमेजिंग तौर-तरीकों के साथ फ्लोरोसेंस को संयोजित करने में सहायक है। उदाहरण के तौर पर, विशिष्ट लेबल वाले लक्ष्यों के लिए रुचि की घटनाओं का अध्ययन करते समय सेल व्यवहार्यता और सामान्य आकृति विज्ञान की निगरानी के लिए डीआईसी का उपयोग वाइडफील्ड प्रतिदीप्ति के साथ संयोजन में किया जा सकता है। एक ही छवि में डीआईसी और प्रतिदीप्ति प्राप्त करना आमतौर पर अव्यावहारिक है, लेकिन एक उचित रूप से कॉन्फ़िगर किए गए माइक्रोस्कोप में दो तकनीकों का क्रमिक रूप से उपयोग किया जा सकता है। इस प्रकार, एपिफ्लोरेसेंस मोड में इमेजिंग के बाद, प्रसारित प्रकाश का उपयोग करके फ्लोरोसेंटली लेबल वाले नमूनों से डीआईसी छवियां प्राप्त की जा सकती हैं। विश्लेषण के बाद दोनों छवियों को मर्ज किया जा सकता है। वर्णक्रमीय रूप से अलग रोशनी (जैसे दृश्य और निकट-अवरक्त) और दोहरे कैमरे या स्प्लिट-व्यू कैमरा एडाप्टर का उपयोग करके उन्नत वाइडफील्ड माइक्रोस्कोप कॉन्फ़िगरेशन में डीआईसी और प्रतिदीप्ति छवियों का एक साथ अधिग्रहण संभव है। अधिकांश लेजर स्कैनिंग कन्फोकल माइक्रोस्कोप में, छवियों को प्रतिदीप्ति और डीआईसी दोनों मोड में एक साथ प्राप्त किया जा सकता है, जिससे अधिग्रहण के बाद प्रसंस्करण की आवश्यकता समाप्त हो जाती है। चरण कंट्रास्ट और हॉफमैन मॉड्यूलेशन कंट्रास्ट का उपयोग वाइडफील्ड प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के संयोजन में भी किया जा सकता है। हालाँकि, इन तकनीकों में, ऑब्जेक्टिव लेंस विशेष है, चाहे वह चरण रिंग हो या हॉफमैन मॉड्यूलेशन प्लेट, इससे उत्सर्जन तीव्रता में 5-15 प्रतिशत की हानि होगी।
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