मल्टीफोटोन माइक्रोस्कोप की फोकल गहराई बढ़ाने की विधियाँ
दो फोटॉन लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप और कैल्शियम इंडिकेटर का संयोजन विवो न्यूरोनल सिग्नल डिटेक्शन के लिए स्वर्ण मानक है। तंत्रिका नेटवर्क में न्यूरॉन्स को तीन आयामी अंतरिक्ष में वितरित किया जाता है, और उनकी गतिविधि की गतिशीलता की निगरानी के लिए वॉल्यूम इमेजिंग दर में तेजी से सुधार करने के तरीके की आवश्यकता होती है। हालाँकि, बड़ी संख्या में छवियों को चित्रित करने के लिए ग्रेटिंग स्कैनिंग मल्टीफोटोन माइक्रोस्कोप का उपयोग करते हुए, यदि उच्च पार्श्व रिज़ॉल्यूशन प्राप्त करने के लिए उच्च संख्यात्मक एपर्चर (एनए) उद्देश्य का उपयोग किया जाता है, तो इसके परिणामस्वरूप छोटी फोकल गहराई होगी। छोटी फोकल गहराई पर वॉल्यूम इमेजिंग प्राप्त करने के लिए,
प्रत्येक फोकल विमान को स्कैन करके कई विमानों की इमेजिंग करते हुए, कुछ माध्यमों से Z{0}}अक्ष स्कैनिंग करना आवश्यक है, जो इमेजिंग गति को बहुत सीमित कर देता है। यदि अक्षीय छवि जानकारी का त्याग किया जा सकता है और फोकस की गहराई को बढ़ाकर एक पार्श्व स्कैन में वॉल्यूम स्कैनिंग प्राप्त की जा सकती है, यानी, वॉल्यूम जानकारी को एक 2 डी छवि पर प्रक्षेपित किया जाता है, तो इमेजिंग गति में काफी सुधार किया जा सकता है। इसे एक्सटेंडेड डेप्थ ऑफ फोकस (ईडीएफ) इमेजिंग कहा जाता है, जो विशेष रूप से विरल जनसंख्या संरचनाओं की इमेजिंग के लिए उपयोगी है, जिनके लिए उच्च अस्थायी रिज़ॉल्यूशन की आवश्यकता होती है, जैसे कि न्यूरोनल गतिविधि की कार्यात्मक इमेजिंग।
माइक्रोस्कोप का अक्षीय और पार्श्व रिज़ॉल्यूशन ऑब्जेक्टिव लेंस के संख्यात्मक एपर्चर (एनए) द्वारा निर्धारित किया जाता है। उच्च NA अक्षीय और पार्श्व रिज़ॉल्यूशन के साथ-साथ एकत्रित प्रकाश की मात्रा को अधिकतम कर सकता है; कम NA के परिणामस्वरूप कम अक्षीय रिज़ॉल्यूशन होगा, यानी फोकस की लंबी गहराई, लेकिन साथ ही पार्श्व रिज़ॉल्यूशन और प्रकाश संग्रह दक्षता का नुकसान होगा। फोकस की गहराई को बढ़ाने की विधि जो आगे पेश की जाएगी वह उच्च पार्श्व रिज़ॉल्यूशन और पर्याप्त प्रकाश प्रवाह को बनाए रखते हुए इसे प्राप्त कर सकती है।
फोकल पतला बेसेल बीम उत्पन्न करने के लिए स्थानिक प्रकाश मॉड्यूलेटर का उपयोग ईडीएफ इमेजिंग प्राप्त कर सकता है, लेकिन स्थानिक प्रकाश मॉड्यूलर भारी होते हैं और संकीर्ण माइक्रोस्कोप स्थानों के साथ संगत होना मुश्किल होता है; इसके विपरीत, अक्षीय पिरामिड पर आधारित बेसेल मॉड्यूल सस्ते और कॉम्पैक्ट हैं, लेकिन वे केवल निश्चित गहराई के फोकल बिंदु उत्पन्न कर सकते हैं और विभिन्न प्रयोगों के लिए उपयुक्त नहीं हैं जिनके लिए फोकल गहराई में निरंतर परिवर्तन की आवश्यकता होती है। इस मुद्दे को संबोधित करने के लिए, 2018 में, रोंगवेन लू एट अल। एक एक्सिकॉन पर आधारित बेसेल मॉड्यूल का प्रदर्शन किया गया, जिसमें बेसेल फोकल बिंदु की अक्षीय लंबाई को लगातार समायोजित करने के लिए केवल एक लेंस को ऑप्टिकल अक्ष के साथ अनुवादित करने की आवश्यकता होती है।
चित्र 1 (ए) बेसेल मॉड्यूल डिवाइस आरेख; (बी) बिंदु प्रसार फ़ंक्शन को प्रयोगात्मक रूप से मापा गया था जब डी क्रमशः -12 मिमी, 0 मिमी और 12 मिमी था; (सी) आधे अधिकतम पर पार्श्व पूर्ण चौड़ाई, (डी) आधे अधिकतम पर अक्षीय पूर्ण चौड़ाई, (ई) शिखर संकेत, और (एफ) एल2 विस्थापन डी के साथ उद्देश्य लेंस के पीछे ऑप्टिकल शक्ति के बीच संबंध
परिवर्तनीय लंबाई बेसेल फोकल बिंदु बनाने के लिए मॉड्यूल डिवाइस चित्र 1 ए में दिखाया गया है। आपतित गॉसियन किरण एक अक्षतंतु और लेंस L1 से गुजरने के बाद एक गोलाकार किरण का आकार लेती है। इसके बाद का गोलाकार एपर्चर मास्क एक्सिकॉन दोषों के कारण होने वाले भटके हुए प्रकाश को अवरुद्ध कर सकता है, जिससे दो फोटॉन उत्तेजना बिंदु प्रसार फ़ंक्शन के अक्षीय वितरण को आकार दिया जा सकता है। बाद में, प्रकाश किरण को लेंस L2 और L3 द्वारा गैल्वेनोमीटर पर प्रक्षेपित किया जाता है, और फिर लेंस L4 और L5 के माध्यम से ऑब्जेक्टिव लेंस के पीछे के फोकल तल तक पहुंचता है।
ये डिज़ाइन पारंपरिक पिरामिड आधारित मॉड्यूल के समान हैं, अंतर यह है कि ऑप्टिकल अक्ष के साथ L2 या L3 को घुमाकर, बेसेल फोकस की अक्षीय लंबाई को लगातार समायोजित किया जा सकता है। चित्र 1 बी - 12 मिमी, 0 मिमी और 12 मिमी के डी मानों के लिए अक्षीय बिंदु प्रसार कार्यों को दिखाता है, अक्षीय पूर्ण चौड़ाई 39 के आधे पर अधिकतम के साथ? मी,24? एम और 14? एम। जैसा कि चित्र 1सी-एफ में दिखाया गया है, लेंस एल2 को बाएं से दाएं घुमाने से अनुप्रस्थ और अक्षीय दोनों दिशाओं में पूरी चौड़ाई लगातार आधी अधिकतम पर बदल सकती है, जिसका अर्थ है कि फोकस की गहराई लगातार बदली जा सकती है। वेक्टर विवर्तन सिद्धांत पर आधारित संख्यात्मक सिमुलेशन परिणाम प्रयोगात्मक डेटा के साथ अच्छे समझौते में हैं। चित्र 2 एक्सिकॉन दोषों पर कुंडलाकार मास्क के विभिन्न आकारों के सुधार प्रभाव की पुष्टि करता है। यह पाया गया है कि पतले कुंडलाकार मास्क आउटपुट बेसेल बीम के अक्षीय तीव्रता वितरण को बेहतर ढंग से अनुकूलित कर सकते हैं, लेकिन साथ ही, वे अधिक बिजली हानि भी पैदा करते हैं।
