लेजर कन्फोकल माइक्रोस्कोपी - विशेषताएं और अनुप्रयोग
लेजर स्कैनिंग कन्फोकल माइक्रोस्कोपी (एलएससीएम) एक प्रकार का माइक्रोस्कोप है जो संयुग्म फोकस तकनीक के आधार पर डिज़ाइन किया गया है, अर्थात, लेजर प्रकाश स्रोत, मापा जाने वाला नमूना और डिटेक्टर सभी एक दूसरे के साथ संयुग्म स्थिति में हैं।
मौलिक
एक सामान्य सूक्ष्मदर्शी में, अवलोकन के छवि तल को डिटेक्टर के साथ ऑब्जेक्टिव लेंस के फोकल तल को मिलाकर आसन्न अक्षीय तल से अलग किया जाता है, जबकि एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप में, नमूने को रोशन करने के लिए एक विवर्तन-सीमित प्रकाश बिंदु का उपयोग किया जाता है और इस अलगाव प्रभाव को बनाने के लिए भटके हुए प्रकाश को फ़िल्टर करने और इस तरह से रिज़ॉल्यूशन में सुधार करने के लिए प्रकाश बिंदु के संयुग्म फोकस पर एकत्रित प्रकाश पथ में एक पिनहोल का उपयोग किया जाता है।
इमेजिंग सुविधाएँ
ऑप्टिकल सेक्शन स्कैनिंग इमेजिंग
लेजर स्कैनिंग कन्फोकल माइक्रोस्कोपी की एक और विशेषता यह है कि यह एक स्कैनिंग इमेजिंग तकनीक है। पारंपरिक वाइड-फील्ड रोशनी तकनीक पूरे नमूने को रोशन करती है, इसलिए छवि को सीधे नग्न आंखों या डिटेक्टर द्वारा कैप्चर किया जा सकता है, लेकिन एलएससीएम एक बीम का उपयोग करता है या स्कैन और छवि बनाने के लिए नमूने के माध्यम से कई केंद्रित बीम गुजरता है। परिणामी छवि को ऑप्टिकल सेक्शन कहा जाता है। निम्नलिखित पारंपरिक वाइड-फील्ड रोशनी विधि और लेजर स्कैनिंग कन्फोकल रोशनी विधि के बीच अंतर दिखाता है।
इसलिए, एक आधुनिक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप की वास्तविक कार्य पद्धति नीचे दिए गए चित्र में दिखाई गई है। लेजर द्वारा उत्सर्जित उत्तेजना प्रकाश एक डाइक्रोइक दर्पण से होकर गुजरता है और गैल्वेनोमीटर की एक जोड़ी के माध्यम से नमूने की x दिशा और y दिशा में स्कैन किया जाता है। नमूने का उत्तेजना (या प्रतिबिंब) प्रकाश पिनहोल के माध्यम से पीएमटी डिटेक्टर में प्रवेश करता है और रिकॉर्ड किया जाता है, और रिकॉर्ड की गई स्कैन की गई छवि को वास्तविक नमूना छवि को फिर से बनाने के लिए कंप्यूटर द्वारा पुनर्निर्मित किया जाता है।
विभिन्न फोकल प्लेन पर "z-स्टैक" छवियां उत्पन्न करें
केवल संयुग्मित नमूना परत से परावर्तित प्रकाश ही संग्रह प्रकाश पथ में छोटे छेद से गुजर सकता है, और शेष अप्रासंगिक नमूना परत प्रतिबिंब छोटे छेद द्वारा अवरुद्ध हो जाते हैं। इसके परिणामस्वरूप महत्वपूर्ण रिज़ॉल्यूशन सुधार हो सकते हैं। एक ही मोटे नमूने की बहुआयामी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और कॉन्फ़ोकल माइक्रोस्कोपी की साथ-साथ तुलना। जब विभिन्न फ़ोकल प्लेन पर छवियों की एक श्रृंखला ली जाती है, तो आमतौर पर "z-स्टैक" के रूप में संदर्भित छवियां उत्पन्न की जा सकती हैं, जो कॉन्फ़ोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा प्रदान किए गए रिज़ॉल्यूशन और कंट्रास्ट लाभ और इन लाभों के अंतर्निहित कारणों को दर्शाती हैं। यह देखा जा सकता है कि ऊतक के ऊपर इमेजिंग प्लेन के साथ स्टैक के शीर्ष पर छवि की जांच करने से फ्लोरोसेंस छवि में बिखरी हुई रोशनी की एक बड़ी मात्रा का पता चलता है, जबकि कॉन्फ़ोकल माइक्रोस्कोपी छवि काली दिखाई देती है। अक्षीय PSF में यह कमी सीधे z-स्टैक के बीच में ऑप्टिकल इंटरफ़ेस पर देखे गए रिज़ॉल्यूशन अंतर का परिणाम है।
वाइडफील्ड लाइटिंग की तुलना में रिज़ॉल्यूशन में काफी सुधार हुआ है
प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी में, एकल बिंदु से उत्सर्जित प्रकाश की तीव्रता को बिंदु प्रसार फ़ंक्शन (PSF) द्वारा वर्णित किया जाता है, और इसका पैटर्न एक एरी डिस्क है। प्रतिदीप्ति प्रणाली के संकल्प को एरी डिस्क की त्रिज्या द्वारा वर्णित किया जा सकता है, जिसे उद्देश्य लेंस के संख्यात्मक एपर्चर और उत्तेजना प्रकाश की तरंग दैर्ध्य द्वारा निर्धारित किया जा सकता है
