दो-फोटॉन प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के बारे में ज्ञान
दो {{0}फोटॉन उत्तेजना का मूल सिद्धांत यह है कि उच्च फोटॉन घनत्व पर, फ्लोरोसेंट अणु एक साथ दो लंबी तरंग दैर्ध्य फोटॉन को अवशोषित कर सकते हैं और तथाकथित उत्तेजित अवस्था जीवनकाल की एक छोटी अवधि के बाद एक छोटी तरंग दैर्ध्य फोटॉन उत्सर्जित कर सकते हैं; इसका प्रभाव फ्लोरोसेंट अणुओं को उत्तेजित करने के लिए लंबी तरंग दैर्ध्य के आधे तरंग दैर्ध्य वाले फोटॉन का उपयोग करने जैसा ही है। दो फोटॉन उत्तेजना के लिए उच्च फोटॉन घनत्व की आवश्यकता होती है, और कोशिकाओं को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए, दो {{3}फोटॉन माइक्रोस्कोपी उच्च {{4}ऊर्जा मोड{{5}लॉक पल्स लेजर का उपयोग करता है। इस लेजर द्वारा उत्सर्जित लेजर में उच्च शिखर ऊर्जा और कम औसत ऊर्जा होती है, जिसकी पल्स चौड़ाई केवल 100 फेमटोसेकंड और आवृत्ति 80 से 100 मेगाहर्ट्ज़ तक होती है। स्पंदित लेजर के फोटॉन पर ध्यान केंद्रित करने के लिए उच्च संख्यात्मक एपर्चर ऑब्जेक्टिव लेंस का उपयोग करते समय, ऑब्जेक्टिव लेंस के फोकल बिंदु पर फोटॉन घनत्व सबसे अधिक होता है, और दो -फोटॉन उत्तेजना केवल ऑब्जेक्टिव लेंस के फोकल बिंदु पर होती है। इसलिए, दो फोटॉन माइक्रोस्कोप को कन्फोकल पिनहोल की आवश्यकता नहीं होती है, जो प्रतिदीप्ति पहचान की दक्षता में सुधार करती है।
सामान्य प्रतिदीप्ति घटना में, उत्तेजना प्रकाश के कम फोटॉन घनत्व के कारण, एक फ्लोरोसेंट अणु एक समय में केवल एक फोटॉन को अवशोषित कर सकता है और फिर विकिरण संक्रमण के माध्यम से एक और फ्लोरोसेंट फोटॉन उत्सर्जित कर सकता है, जिसे एकल फोटॉन प्रतिदीप्ति के रूप में जाना जाता है। प्रकाश स्रोतों के रूप में लेज़रों का उपयोग करते हुए प्रतिदीप्ति उत्तेजना प्रक्रियाओं के लिए, दो -फ़ोटॉन या यहां तक कि मल्टीफ़ोटो प्रतिदीप्ति घटनाएँ घटित हो सकती हैं। इस मामले में, उपयोग किए जाने वाले उत्तेजना प्रकाश स्रोत में उच्च तीव्रता और फोटॉन घनत्व होता है जो एक साथ दो फोटॉन को अवशोषित करने के लिए फ्लोरोसेंट अणुओं की आवश्यकता को पूरा करता है। उत्तेजना प्रकाश स्रोत के रूप में एक सामान्य लेजर का उपयोग करने की प्रक्रिया में, फोटॉन घनत्व अभी भी दो फोटॉन अवशोषण घटना उत्पन्न करने के लिए अपर्याप्त है। आमतौर पर, फेमटोसेकंड पल्स लेजर का उपयोग किया जाता है, जिसमें तात्कालिक शक्ति मेगावाट स्तर तक पहुंच जाती है। इसलिए, दो फोटॉन प्रतिदीप्ति की तरंग दैर्ध्य उत्तेजना प्रकाश की तरंग दैर्ध्य से कम है, जो आधे उत्तेजना तरंग दैर्ध्य उत्तेजना द्वारा उत्पन्न प्रभाव के बराबर है।
