लेजर स्कैनिंग मल्टीफोटोन माइक्रोस्कोपी के सुधार लाभ
लेजर स्कैनिंग मल्टीफोटोन माइक्रोस्कोपी ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी में एक प्रमुख प्रगति का प्रतिनिधित्व करती है। यह जीवित कोशिकाओं, स्थिर कोशिकाओं और ऊतकों में गहरी संरचनाओं के अवलोकन को सक्षम बनाता है, जबकि स्पष्ट और तेज बहुस्तरीय जेड-प्लेन संरचनाओं-अर्थात् ऑप्टिकल अनुभागों को कैप्चर करता है-जिसका उपयोग आगे नमूनों की त्रि-आयामी ठोस संरचना के पुनर्निर्माण के लिए किया जा सकता है।
एक कन्फोकल माइक्रोस्कोप एक लेजर प्रकाश स्रोत को अपनाता है। लेजर बीम को ऑब्जेक्टिव लेंस के पीछे के फोकल प्लेन को पूरी तरह से रोशन करने के लिए विस्तारित किया जाता है, फिर ऑब्जेक्टिव लेंस सिस्टम से गुजरता है और नमूने के फोकल प्लेन पर एक बेहद छोटे स्थान में परिवर्तित हो जाता है। ऑब्जेक्टिव लेंस के संख्यात्मक एपर्चर के आधार पर, प्रबुद्ध स्थान का व्यास लगभग 0.25 से 0.8 μm तक होता है, अक्षीय गहराई लगभग 0.5 से 1.5 μm तक होती है। कन्फोकल स्पॉट का आकार माइक्रोस्कोप डिजाइन, लेजर तरंग दैर्ध्य, उद्देश्य विशेषताओं, स्कैनिंग यूनिट सेटिंग्स और नमूना गुणों द्वारा निर्धारित किया जाता है।
वाइड-फील्ड माइक्रोस्कोप में एक बड़ी रोशनी रेंज और गहरी रोशनी की गहराई होती है, जबकि कन्फोकल माइक्रोस्कोपी रोशनी को फोकल प्लेन पर एक सटीक फोकल बिंदु में केंद्रित करती है। कन्फोकल माइक्रोस्कोपी का मुख्य लाभ मोटे फ्लोरोसेंट नमूनों (50 माइक्रोन या अधिक तक) पर बारीक ऑप्टिकल सेक्शनिंग करने की क्षमता में निहित है, प्रत्येक अनुभाग की मोटाई 0.5 से 1.5 माइक्रोन तक होती है।
माइक्रोस्कोप की सटीक Z-अक्ष स्टेपिंग मोटर के माध्यम से नमूने को लंबवत घुमाकर ऑप्टिकल अनुभाग छवियों की एक श्रृंखला प्राप्त की जाती है। छवि संकेत संग्रह सख्ती से लक्षित फोकल विमान तक ही सीमित है और नमूने के भीतर अन्य स्थितियों से उत्पन्न होने वाले संकेतों के हस्तक्षेप से मुक्त है। पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति को खत्म करने और सिग्नल-टू-शोर अनुपात में सुधार करने के बाद, कन्फोकल छवियां पारंपरिक वाइड-फील्ड प्रतिदीप्ति छवियों की तुलना में काफी अधिक कंट्रास्ट और रिज़ॉल्यूशन प्रदर्शित करती हैं।
अधिकांश नमूनों में, जटिल संरचनात्मक घटक आपस में जुड़कर जटिल प्रणालियाँ बनाते हैं। एक बार पर्याप्त संख्या में ऑप्टिकल अनुभाग एकत्र हो जाने पर, पेशेवर सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके त्रि-आयामी पुनर्निर्माण पूरा किया जा सकता है। कोशिकाओं और ऊतकों के बीच जटिल संरचनात्मक और कार्यात्मक संबंधों को स्पष्ट करने के लिए इस प्रयोगात्मक विधि को जैविक अनुसंधान में व्यापक रूप से लागू किया गया है।
