उपयुक्त प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी का चयन कैसे करें
प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप प्रयोगशालाओं और पैथोलॉजी विभागों में एक मानक सूक्ष्म इमेजिंग उपकरण है, जो अवलोकन और इमेजिंग के लिए प्रतिदीप्ति विशेषताओं का उपयोग करता है। इसका व्यापक रूप से कोशिका जीव विज्ञान, तंत्रिका जीव विज्ञान, वनस्पति विज्ञान, सूक्ष्म जीव विज्ञान, विकृति विज्ञान, आनुवंशिकी आदि जैसे विभिन्न क्षेत्रों में उपयोग किया जाता है। प्रतिदीप्ति इमेजिंग में उच्च संवेदनशीलता और विशिष्टता के फायदे हैं, जो इसे विशिष्ट प्रोटीन, ऑर्गेनेल आदि के वितरण का निरीक्षण करने के लिए बहुत उपयुक्त बनाता है। ऊतकों और कोशिकाओं में, सह-स्थानीकरण और अंतःक्रियाओं का अध्ययन करना, जीवन की गतिशील प्रक्रियाओं जैसे आयन सांद्रता परिवर्तन आदि पर नज़र रखना।
सूक्ष्मदर्शी का चयन
प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी मुख्य रूप से तीन श्रेणियों में विभाजित हैं: सीधे प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी (टुकड़े करने के लिए उपयुक्त), उल्टे प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी (जीवित कोशिकाओं के लिए और टुकड़ा करने के लिए भी उपयुक्त), और स्टीरियो प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी (बड़े नमूनों के लिए उपयुक्त, जैसे पौधे, जेब्राफिश (वयस्क/ भ्रूणीय), मेडका, चूहे/चूहे के अंग, आदि)।
फ्लोरोसेंट फिल्टर ब्लॉक का चयन
फ़िल्टर ब्लॉकों के चयन में न केवल फ्लोरोसेंट जांच की उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य पर विचार करना चाहिए, बल्कि यह भी विचार करना चाहिए कि क्या गैर-विशिष्ट उत्तेजना है और क्या बहु-रंग लेबल वाले नमूनों के लिए रंग क्रॉसस्टॉक है। प्रयोग में, हम उत्तेजना के लिए यथासंभव उत्तेजना शिखर के निकटतम तरंग दैर्ध्य का चयन करेंगे, और प्राप्त सीमा में शिखर उत्सर्जन शामिल होना चाहिए। एलेक्सा फ्लोर 488 का उत्तेजना शिखर 500nm है, और एक 480/40 उत्तेजना फ़िल्टर को प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप में चुना जा सकता है। प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी में आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले फ्लोरोसेंट फिल्टर ब्लॉक को दो प्रकारों में विभाजित किया जा सकता है: लॉन्ग पास (एलपी) और बैंड पास (बीपी), जिन्हें जरूरतों के अनुसार चुनने की भी आवश्यकता होती है।
कन्फोकल माइक्रोस्कोप
पारंपरिक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी अवलोकनों में, फ्लोरोसेंट लेबल वाले पदार्थों और सहज प्रतिदीप्ति संरचनाओं के ओवरलैप के कारण, वे कसकर एक साथ बंधे होते हैं। हालाँकि, पारंपरिक गिरती प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी उद्देश्य न केवल फोकल तल से प्रकाश एकत्र करते हैं, बल्कि फोकल तल पर प्रकाश को ऊपर और नीचे बिखेरते हैं, जिसके परिणामस्वरूप छवि रिज़ॉल्यूशन और कंट्रास्ट में महत्वपूर्ण कमी आती है।
कन्फ़ोकल इमेजिंग केवल स्व-फ़ोकसिंग विमान से परावर्तित प्रकाश का पता लगाती है, इस प्रकार उपरोक्त समस्या का समाधान करती है। प्रकाश स्रोत एक पिनहोल के माध्यम से फोकल प्लेन पर एक छोटा और बारीक स्थान बनाता है, और फोकल प्लेन से उत्सर्जित प्रकाश को ऑब्जेक्टिव लेंस के माध्यम से एकत्र किया जाता है। ऑब्जेक्टिव लेंस के फोकल तल के ऊपर या नीचे बिंदुओं से उत्सर्जित अधिकांश प्रतिदीप्ति पिनहोल में परिवर्तित नहीं हो सकती है। केवल फोकल विमान में स्थित प्रतिदीप्ति और डिफोकस्ड प्रतिदीप्ति का एक छोटा सा हिस्सा पिनहोल से गुजर सकता है, जबकि फोकल विमान के बाहर प्रकाश किरण पिनहोल प्लेट के सामने या पीछे परिवर्तित हो जाती है और पिनहोल के माध्यम से डिटेक्टर में प्रवेश करने से अवरुद्ध हो जाती है। पता लगाई गई छवि फोकल प्लेन से है, इसलिए अंतिम छवि गुणवत्ता में काफी सुधार हुआ है।
लेजर स्कैनिंग कन्फोकल माइक्रोस्कोपी के विभिन्न फायदों और व्यावहारिकता के कारण, यह वर्तमान में उच्च परिशुद्धता कोशिका जीव विज्ञान, वनस्पति विज्ञान और कोशिका अनुसंधान क्षेत्रों में एक अनिवार्य प्रयोगात्मक सहायक है। साथ ही, भविष्य के वैज्ञानिक अनुसंधान केंद्रों में यह सबसे बुनियादी और मुख्य अनुसंधान उपकरण होगा।
