प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी और साधारण प्रकाश सूक्ष्मदर्शी के बीच अंतर
प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी पारंपरिक ऑप्टिकल सूक्ष्मदर्शी से भिन्न होते हैं। सामान्य प्रकाश स्रोत से प्रकाश के साथ नमूनों का अवलोकन करने के बजाय, वे माइक्रोस्कोप स्लाइड पर नमूने के भीतर फ्लोरोसेंट पदार्थों को उत्तेजित करने के लिए एक विशिष्ट तरंग दैर्ध्य (आमतौर पर पराबैंगनी या नीली-बैंगनी प्रकाश) के प्रकाश का उपयोग करते हैं, जिससे ये पदार्थ प्रतिदीप्ति उत्सर्जित करते हैं। इसलिए, प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी का प्रकाश स्रोत सीधे नमूने को प्रकाशित नहीं करता है; यह नमूने में अंतर्जात फ्लोरोसेंट पदार्थों को उत्तेजित करने के लिए एक ऊर्जा स्रोत के रूप में कार्य करता है। हम नमूने को प्रकाश स्रोत से रोशनी के कारण नहीं देख सकते हैं, बल्कि इसलिए कि नमूने के अंदर के फ्लोरोसेंट पदार्थ उत्तेजना प्रकाश ऊर्जा को अवशोषित करते हैं और फिर प्रतिदीप्ति उत्सर्जित करते हैं।
इससे पता चलता है कि प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप की मुख्य विशेषता यह है कि इसका प्रकाश स्रोत एक विशिष्ट तरंग दैर्ध्य बैंड के उत्तेजना प्रकाश की आपूर्ति कर सकता है, जिससे निरीक्षण किए गए नमूने में फ्लोरोसेंट पदार्थ पर्याप्त तीव्रता के प्रतिदीप्ति उत्सर्जित करने में सक्षम हो जाते हैं। इस बीच, एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप को संबंधित फ़िल्टर सिस्टम से सुसज्जित किया जाना चाहिए। यह प्रतिदीप्ति हिस्टोकैमिस्ट्री के लिए एक आवश्यक उपकरण है। एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप मुख्य रूप से एक अति-उच्च दबाव प्रकाश स्रोत, एक फिल्टर प्रणाली (उत्तेजना फिल्टर और बाधा फिल्टर सहित), एक ऑप्टिकल प्रणाली और एक फोटोग्राफिक प्रणाली से बना होता है। यह फ्लोरोसेंट पदार्थों को उत्तेजित करने के लिए एक विशिष्ट तरंग दैर्ध्य के प्रकाश का उपयोग करके काम करता है।
① प्रतिदीप्ति उत्तेजना के तरीकेउत्तेजना प्रकाश की तरंग दैर्ध्य सीमा के अनुसार, दो प्रकार होते हैं: यूवी उत्तेजना विधि (पराबैंगनी रोशनी विधि) और बीवी उत्तेजना विधि (नीली-बैंगनी रोशनी विधि)। यूवी उत्तेजना विधि उत्तेजना के लिए 400 एनएम से कम पराबैंगनी प्रकाश का उपयोग करती है। यह अदृश्य प्रतिदीप्ति उत्पन्न करता है, इसलिए देखी गई प्रतिदीप्ति नमूने से ही आती है। यह विधि पृष्ठभूमि के ऑटोफ्लोरेसेंस से विशिष्ट प्रतिदीप्ति को आसानी से अलग करती है।
② बीवी उत्तेजना विधि बीवी उत्तेजना विधि 404 एनएम और 434 एनएम पर केंद्रित बैंगनी से नीले तक उत्तेजना प्रकाश का उपयोग करती है। चूंकि नमूने को विकिरणित करने के लिए नीली रोशनी का उपयोग किया जाता है, इसलिए इस विधि के लिए उत्तेजना फिल्टर प्रणाली को नीली रोशनी को पूरी तरह से अवरुद्ध करना चाहिए और केवल आवश्यक हरी और पीली रोशनी को गुजरने देना चाहिए। फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी धुंधलापन के लिए, उत्तेजना प्रकाश की अधिकतम अवशोषण तरंग दैर्ध्य फ्लोरोसेंट डाई की अधिकतम उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के करीब है। इस कारण से, बीवी उत्तेजना के लिए सेट किए गए फ़िल्टर को कट-ऑफ बैरियर फ़िल्टर का उपयोग करना चाहिए। यह विधि उत्तेजना के लिए नीली रोशनी का उपयोग करती है, इसलिए प्रतिदीप्ति संग्रह दक्षता अपेक्षाकृत अधिक है और उज्जवल छवियां प्राप्त की जा सकती हैं। इसका नुकसान यह है कि 500 एनएम से ऊपर प्रतिदीप्ति का पता नहीं लगाया जा सकता है, और 500 एनएम से ऊपर केवल पीले-हरे चित्र ही देखे जा सकते हैं। फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी धुंधलापन में, विशिष्टता का निर्णय रंग की जानकारी पर बहुत अधिक निर्भर करता है, इसलिए सूक्ष्म विशिष्टता पर चर्चा करते समय बीवी उत्तेजना विधि की खामी एक बड़ी सीमा हो सकती है।
