प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी और साधारण ऑप्टिकल सूक्ष्मदर्शी के बीच अंतर और विशेषताएं
प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप साधारण ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप से इस मायने में भिन्न है कि यह सामान्य प्रकाश स्रोतों की रोशनी में नमूनों का निरीक्षण नहीं करता है। इसके बजाय, यह माइक्रोस्कोप के नीचे नमूने के अंदर फ्लोरोसेंट पदार्थों को उत्तेजित करने के लिए प्रकाश की एक निश्चित तरंग दैर्ध्य (आमतौर पर पराबैंगनी प्रकाश, नीली बैंगनी रोशनी) का उपयोग करता है, जिससे वे प्रतिदीप्ति उत्सर्जित करते हैं। इसलिए, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप में प्रकाश स्रोत की भूमिका प्रत्यक्ष रोशनी नहीं है, बल्कि नमूने के अंदर फ्लोरोसेंट पदार्थों को उत्तेजित करने के लिए एक ऊर्जा स्रोत के रूप में है। हम नमूनों का निरीक्षण क्यों कर सकते हैं इसका कारण प्रकाश स्रोत की रोशनी नहीं है, बल्कि उत्तेजित प्रकाश ऊर्जा को अवशोषित करने के बाद नमूने के अंदर फ्लोरोसेंट पदार्थों द्वारा प्रदर्शित प्रतिदीप्ति घटना है। इससे यह देखा जा सकता है कि प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी की विशेषता मुख्य रूप से यह है कि इसका प्रकाश स्रोत एक विशिष्ट तरंग दैर्ध्य सीमा में बड़ी मात्रा में उत्तेजना प्रकाश की आपूर्ति कर सकता है, ताकि नमूने में फ्लोरोसेंट पदार्थ उत्तेजना प्रकाश की आवश्यक तीव्रता प्राप्त कर सकें। साथ ही, प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी में संबंधित फिल्टर सिस्टम होना चाहिए। प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी प्रतिदीप्ति ऊतक रसायन विज्ञान में एक मौलिक उपकरण है। यह मुख्य घटकों से बना है जैसे कि एक अल्ट्रा-हाई वोल्टेज प्रकाश स्रोत, एक फिल्टर सिस्टम (उत्तेजना और दमन फिल्टर प्लेट्स सहित), एक ऑप्टिकल सिस्टम और एक फोटोग्राफी सिस्टम। यह नमूने को उत्तेजित करने और प्रतिदीप्ति उत्सर्जित करने के लिए एक निश्चित तरंग दैर्ध्य के प्रकाश का उपयोग करता है।
1. प्रतिदीप्ति उत्तेजना के तरीके: प्रकाश की तरंग दैर्ध्य सीमा के अनुसार, दो प्रकार होते हैं: यूवी उत्तेजना विधि (पराबैंगनी रोशनी का उपयोग करके) और बीवी उत्तेजना विधि (नीले बैंगनी प्रकाश का उपयोग करके)। यूवी उत्तेजना विधि उत्तेजना के लिए 400 एनएम से कम पराबैंगनी प्रकाश का उपयोग करती है। इस विधि में दृश्य उत्तेजना प्रकाश नहीं होता है, इसलिए देखी गई प्रतिदीप्ति डाई की अंतर्निहित प्रतिदीप्ति को प्रदर्शित करती है, जिससे नमूने पर विशिष्ट प्रतिदीप्ति को पृष्ठभूमि ऊतक के स्वयं प्रतिदीप्ति से अलग करना आसान हो जाता है।
2. बीवी उत्तेजना विधि: इसमें 404 एनएम और 434 एनएम पर केंद्रित पराबैंगनी से नीली रोशनी तक उत्तेजना शामिल है। यह विधि नमूने को विकिरणित करने के लिए नीली रोशनी का उपयोग करती है, इसलिए प्रतिदीप्ति अवलोकन प्रणाली के कटऑफ फिल्टर को एक ऐसे फिल्टर का उपयोग करना चाहिए जो नीली रोशनी को पूरी तरह से अवरुद्ध कर सके और आवश्यक हरे और पीले प्रतिदीप्ति से पूरी तरह गुजर सके। फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी विधि के लिए फ्लोरोसेंट वर्णक का उपयोग किया जाता है। उत्तेजना प्रकाश की अधिकतम अवशोषण तरंग दैर्ध्य और प्रतिदीप्ति की अधिकतम उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य अपेक्षाकृत करीब हैं, इसलिए बीवी उत्तेजना विधि में उपयोग किए जाने वाले फिल्टर को एक तेज कट फिल्टर का उपयोग करना चाहिए। यह विधि नीली रोशनी को उत्तेजना प्रकाश के रूप में उपयोग कर सकती है, इसलिए फ्लोरोसेंट पिगमेंट की अवशोषण दक्षता अधिक होती है, और उज्जवल छवियां प्राप्त की जा सकती हैं। नुकसान यह है कि 500nm से नीचे की प्रतिदीप्ति देखी नहीं जा सकती, जबकि 500nm से ऊपर की प्रतिदीप्ति पूरी छवि को पीली दिखाई देती है। फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी विधि में, विशिष्टता ज्यादातर फ्लोरोसेंट पिगमेंट के अद्वितीय रंग द्वारा निर्धारित की जाती है, इसलिए सूक्ष्म विशिष्टता पर चर्चा करते समय, ऊपर उल्लिखित बीवी उत्तेजना विधि की कमियां अक्सर महत्वपूर्ण प्रभाव डालती हैं।
