प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप और सामान्य माइक्रोस्कोप के बीच अंतर
1. प्रकाश व्यवस्था को देखें
प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी की रोशनी विधि आम तौर पर एपी-प्रकार होती है, अर्थात, प्रकाश स्रोत को वस्तुनिष्ठ लेंस के माध्यम से परीक्षण नमूने पर रखा जाता है।
2. संकल्प को देखो
प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी अपेक्षाकृत कम तरंग दैर्ध्य के साथ प्रकाश स्रोत के रूप में पराबैंगनी प्रकाश का उपयोग करते हैं, लेकिन संकल्प साधारण ऑप्टिकल सूक्ष्मदर्शी की तुलना में अधिक होता है।
3, फिल्टर में अंतर
प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी दो विशेष फिल्टर का उपयोग करता है, जिसका उपयोग प्रकाश स्रोत के सामने दृश्यमान प्रकाश को फ़िल्टर करने के लिए किया जाता है, और पराबैंगनी प्रकाश को फ़िल्टर करने के लिए वस्तुनिष्ठ लेंस और ऐपिस के बीच उपयोग किया जाता है, जो मानव आंखों की रक्षा कर सकता है।
प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप भी एक प्रकार का ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप है, मुख्यतः क्योंकि प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप द्वारा उत्तेजित तरंग दैर्ध्य छोटा होता है, इसलिए यह प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप और साधारण माइक्रोस्कोप की संरचना और उपयोग में अंतर की ओर जाता है। अधिकांश प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी में कमजोर प्रकाश को पकड़ने का अच्छा कार्य होता है। , इसलिए अत्यंत कमजोर प्रतिदीप्ति के तहत, इसकी इमेजिंग क्षमता भी अच्छी है। हाल के वर्षों में प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के निरंतर सुधार के साथ युग्मित, शोर भी बहुत कम हो गया है। इसलिए, अधिक से अधिक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी का उपयोग किया जाता है।
टू-फोटॉन फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का ज्ञान
दो-फोटोन उत्तेजना का मूल सिद्धांत है: उच्च फोटॉन घनत्व के मामले में, फ्लोरोसेंट अणु एक ही समय में दो लंबी-तरंग दैर्ध्य फोटोन को अवशोषित कर सकते हैं, और एक बहुत ही कम तथाकथित उत्तेजित अवस्था जीवनकाल के बाद, एक लघु-तरंग दैर्ध्य फोटॉन का उत्सर्जन करते हैं। ; प्रभाव एक फ्लोरोसेंट अणु को उत्तेजित करने के लिए आधे लंबे तरंग दैर्ध्य के साथ एक फोटॉन का उपयोग करने के समान है। दो-फोटॉन उत्तेजना के लिए उच्च फोटॉन घनत्व की आवश्यकता होती है, और कोशिकाओं को नुकसान न पहुंचाने के लिए, दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी उच्च-ऊर्जा मोड-लॉक स्पंदित लेसरों का उपयोग करता है। यह लेजर उच्च शिखर ऊर्जा और कम औसत ऊर्जा के साथ केवल 100 फेमटोसेकंड की पल्स चौड़ाई और 80 से 100 मेगाहर्ट्ज की आवृत्ति के साथ लेजर प्रकाश का उत्सर्जन करता है। जब एक उच्च संख्यात्मक एपर्चर ऑब्जेक्टिव लेंस का उपयोग स्पंदित लेजर के फोटॉनों को फोकस करने के लिए किया जाता है, तो ऑब्जेक्टिव लेंस के फोकल बिंदु पर फोटॉन घनत्व उच्चतम होता है, और दो-फोटॉन उत्तेजना केवल ऑब्जेक्टिव लेंस के फोकल बिंदु पर होती है, इसलिए दो-फोटॉन माइक्रोस्कोप को कॉन्फोकल पिनहोल की आवश्यकता नहीं होती है, जो फ्लोरेसेंस डिटेक्शन दक्षता में सुधार करता है।
सामान्य प्रतिदीप्ति घटना में, उत्तेजना प्रकाश के कम फोटॉन घनत्व के कारण, एक फ्लोरोसेंट अणु एक ही समय में केवल एक फोटॉन को अवशोषित कर सकता है, और फिर विकिरण संक्रमण के माध्यम से एक फ्लोरोसेंट फोटॉन का उत्सर्जन करता है, जिसे सिंगल-फोटॉन प्रतिदीप्ति कहा जाता है। प्रकाश स्रोत के रूप में लेजर के साथ प्रतिदीप्ति उत्तेजना प्रक्रिया के लिए, दो-फोटॉन या यहां तक कि बहु-फोटॉन प्रतिदीप्ति घटना हो सकती है। इस समय, उपयोग किए जाने वाले उत्तेजना प्रकाश स्रोत की तीव्रता अधिक होती है, और फोटॉन घनत्व आवश्यकता को पूरा करता है कि फ्लोरोसेंट अणु एक ही समय में दो फोटॉन को अवशोषित करता है। उत्तेजना प्रकाश स्रोत के रूप में एक सामान्य लेजर का उपयोग करने की प्रक्रिया में, फोटॉन घनत्व अभी भी दो-फोटॉन अवशोषण उत्पन्न करने के लिए पर्याप्त नहीं है। आमतौर पर, एक फेमटोसेकंड स्पंदित लेजर का उपयोग किया जाता है, और इसकी तात्कालिक शक्ति मेगावाट के क्रम तक पहुँच सकती है। इसलिए, दो-फोटॉन प्रतिदीप्ति की तरंग दैर्ध्य उत्तेजना प्रकाश की तरंग दैर्ध्य से कम होती है, जो अर्ध-उत्तेजना तरंग दैर्ध्य उत्तेजना द्वारा उत्पन्न प्रभाव के बराबर होती है।
दो फोटॉन प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के कई फायदे हैं:
1) लघु-तरंग दैर्ध्य प्रकाश की तुलना में लंबी-तरंग दैर्ध्य प्रकाश बिखरने से कम प्रभावित होता है और आसानी से नमूने में प्रवेश कर सकता है;
2) फोकल विमान के बाहर फ्लोरोसेंट अणु उत्तेजित नहीं होते हैं, ताकि अधिक उत्तेजना प्रकाश फोकल विमान तक पहुंच सके, ताकि उत्तेजना प्रकाश गहरे नमूनों में प्रवेश कर सके;
3) लंबी-तरंग दैर्ध्य निकट-अवरक्त प्रकाश लघु-तरंग दैर्ध्य प्रकाश की तुलना में कोशिकाओं के लिए कम विषैला होता है;
4) दो फोटॉन माइक्रोस्कोपी के साथ नमूनों को देखते समय, फोटोब्लीचिंग और फोटोटॉक्सिसिटी केवल फोकल प्लेन में मौजूद होते हैं। इसलिए, जीवित कोशिकाओं को देखने के लिए, या निश्चित-बिंदु फोटोब्लीचिंग प्रयोगों को करने के लिए, एकल-फोटॉन माइक्रोस्कोपी की तुलना में दो-फोटोन माइक्रोस्कोपी मोटे नमूनों को देखने के लिए अधिक उपयुक्त है।
कन्फोकल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का ज्ञान
Confocal प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का मूल सिद्धांत: नमूना को रोशन करने के लिए एक बिंदु प्रकाश स्रोत का उपयोग करके, फोकल तल पर एक अच्छी तरह से परिभाषित रूपरेखा के साथ एक छोटा प्रकाश स्थान बनता है। बीम फाड़नेवाला का गठन। बीम फाड़नेवाला सीधे डिटेक्टर को प्रतिदीप्ति भेजता है। प्रकाश स्रोत और डिटेक्टर के सामने एक पिनहोल होता है, जिसे क्रमशः रोशनी पिनहोल और डिटेक्शन पिनहोल कहा जाता है। दोनों के ज्यामितीय आयाम समान हैं, लगभग 100-200 एनएम; फोकल प्लेन पर लाइट स्पॉट के सापेक्ष, दोनों संयुग्मित होते हैं, यानी लाइट स्पॉट लेंस की एक श्रृंखला से होकर गुजरता है, और अंत में एक ही समय में रोशनी पिनहोल और डिटेक्शन पिनहोल पर ध्यान केंद्रित किया जा सकता है। इस तरह, फ़ोकल प्लेन से प्रकाश को डिटेक्शन होल की सीमा के भीतर केंद्रित किया जा सकता है, जबकि फ़ोकल प्लेन के ऊपर या नीचे से बिखरी हुई रोशनी डिटेक्शन होल से बाहर ब्लॉक हो जाती है और इसकी इमेज नहीं ली जा सकती। नमूना लेजर के साथ बिंदु से बिंदु स्कैन किया जाता है, और पिनहोल का पता लगाने के बाद फोटोमल्टीप्लायर ट्यूब भी बिंदु से संबंधित प्रकाश बिंदु बिंदु की मुखर छवि प्राप्त करता है, जिसे डिजिटल सिग्नल में परिवर्तित किया जाता है और कंप्यूटर पर प्रेषित किया जाता है, और अंत में एकत्र किया जाता है पूरे फोकल प्लेन की एक स्पष्ट कन्फोकल छवि में स्क्रीन। .
प्रत्येक फोकल समतल छवि वास्तव में नमूने का एक ऑप्टिकल क्रॉस-सेक्शन है, और इस ऑप्टिकल क्रॉस-सेक्शन में हमेशा एक निश्चित मोटाई होती है, जिसे ऑप्टिकल स्लाइस भी कहा जाता है। चूँकि फोकल बिंदु पर प्रकाश की तीव्रता गैर-फोकल बिंदु की तुलना में बहुत अधिक होती है, और गैर-फोकल समतल प्रकाश को पिनहोल द्वारा फ़िल्टर किया जाता है, कन्फोकल सिस्टम के क्षेत्र की गहराई लगभग शून्य होती है, और साथ में स्कैनिंग होती है। जेड-अक्ष ऑप्टिकल टोमोग्राफी का एहसास कर सकता है, जो नमूने के केंद्रित स्थान पर एक द्वि-आयामी ऑप्टिकल अनुभाग का निरीक्षण करता है। जेड-एक्सिस (ऑप्टिकल एक्सिस) स्कैनिंग के साथ एक्सवाई प्लेन (फोकल प्लेन) स्कैनिंग को मिलाकर, क्रमिक परतों की द्वि-आयामी छवियों को जमा करके और विशेष कंप्यूटर सॉफ्टवेयर द्वारा प्रसंस्करण करके, नमूने की त्रि-आयामी छवि प्राप्त की जा सकती है।
यही है, डिटेक्शन पिनहोल और लाइट सोर्स पिनहोल हमेशा एक ही बिंदु पर केंद्रित होते हैं, ताकि फ़ोकसिंग प्लेन के बाहर उत्साहित प्रतिदीप्ति डिटेक्शन पिनहोल में प्रवेश न कर सके।
कंफोकल लेजर के कार्य सिद्धांत की सरल अभिव्यक्ति यह है कि यह प्रकाश स्रोत के रूप में एक लेजर का उपयोग करता है, और पारंपरिक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप इमेजिंग के आधार पर, एक लेजर स्कैनिंग डिवाइस और एक संयुग्म फोकसिंग डिवाइस संलग्न होते हैं, और डिजिटल छवि अधिग्रहण और प्रसंस्करण सिस्टम को कंप्यूटर द्वारा नियंत्रित किया जाता है।
