सूक्ष्मजीवों की संख्या का निर्धारण - माइक्रोस्कोप की सीधी गिनती विधि!
बैक्टीरिया की जनसंख्या वृद्धि कोशिका संख्या में वृद्धि या सेलुलर द्रव्यमान में वृद्धि से प्रकट होती है। कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करने के तरीकों में डायरेक्ट माइक्रोस्कोप काउंटिंग मेथड, प्लेट कॉलोनी काउंटिंग मेथड, फोटोइलेक्ट्रिक ऑयल रेशियो मेथड, मैक्सिमम प्रॉबेबिलिटी मेथड और मेम्ब्रेन फिल्ट्रेशन मेथड शामिल हैं। सेल मैटर को मापने के तरीकों में सेल ड्राई वेट का निर्धारण, कुछ सेलुलर घटकों जैसे नाइट्रोजन, आरएनए और डीएनए सामग्री का निर्धारण और मेटाबोलाइट्स का निर्धारण शामिल है। संक्षेप में, सूक्ष्मजीवों के विकास को मापने के लिए कई तरीके हैं, प्रत्येक के अपने फायदे और नुकसान हैं, और उन्हें विशिष्ट स्थिति के अनुसार चुना जाना चाहिए। यह प्रयोग मुख्य रूप से उत्पादन और वैज्ञानिक अनुसंधान में आमतौर पर उपयोग की जाने वाली माइक्रोस्कोप डायरेक्ट काउंटिंग विधि का परिचय देता है।
1. उद्देश्य आवश्यकताएँ
1. रक्त कोशिका गणना के सिद्धांत को स्पष्ट कीजिए।
2. रक्त कोशिका काउंटर का उपयोग करके सूक्ष्मजीवों की गणना करने की विधि में महारत हासिल करें।
2. मूल सिद्धांत
माइक्रोस्कोप सीधी गिनती विधि एक निश्चित क्षेत्र और मात्रा (जिसे बैक्टीरिया काउंटर भी कहा जाता है) के साथ एक विशेष ग्लास स्लाइड पर परीक्षण किए जाने वाले नमूने के निलंबन की थोड़ी मात्रा को सीधे गिनने के लिए एक सरल, तेज़ और सहज विधि है। तरीके। वर्तमान में, देश और विदेश में आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले बैक्टीरिया काउंटर हैं: ब्लड सेल काउंटिंग बोर्ड, पीटरऑफ़-हॉसर बैक्टीरिया काउंटर और हॉक्सले बैक्टीरिया काउंटर, आदि। इनका उपयोग खमीर, बैक्टीरिया, मोल्ड बीजाणुओं और अन्य निलंबन की गिनती के लिए किया जा सकता है, और मूल सिद्धांत वही है। बाद के दो प्रकार के बैक्टीरिया काउंटरों की कुल मात्रा 0। 02mm3 एक कवर ग्लास से ढके होने के बाद, और कवर ग्लास और स्लाइड के बीच की दूरी केवल 0.02mm है, इसलिए तेल विसर्जन वस्तुनिष्ठ लेंस का उपयोग बैक्टीरिया जैसी छोटी कोशिकाओं को देखने और निरीक्षण करने के लिए किया जा सकता है। गिनती करना। इन बैक्टीरियोमीटरों के अलावा, सीधे माइक्रोस्कोप के नीचे देखे गए दृश्य क्षेत्र के क्षेत्र में स्मीयर के क्षेत्र के अनुपात के लिए एक अनुमान विधि भी है, जो आम तौर पर दूध की बैक्टीरियोलॉजिकल परीक्षा के लिए उपयोग की जाती है। माइक्रोस्कोप डायरेक्ट काउंटिंग मेथड के फायदे सहज, तेज और संचालित करने में आसान हैं। हालांकि, इस पद्धति का नुकसान यह है कि मापा परिणाम आमतौर पर मृत और जीवित कोशिकाओं का योग होता है। वर्तमान में, इस कमी को दूर करने के लिए कुछ तरीके हैं, जैसे व्यवहार्य बैक्टीरिया धुंधला माइक्रोचैम्बर कल्चर (अल्पकालिक) का संयोजन और केवल व्यवहार्य बैक्टीरिया की गिनती के उद्देश्य को प्राप्त करने के लिए कोशिका विभाजन अवरोधकों को जोड़ना।
इस प्रयोग में, प्रत्यक्ष सूक्ष्म गणना के लिए एक उदाहरण के रूप में एक हेमोसाइटोमीटर का उपयोग किया गया था। अन्य दो प्रकार के बैक्टीरिया काउंटरों के उपयोग के लिए, कृपया प्रत्येक निर्माता के निर्देशों को देखें। एक हेमोसाइटोमीटर के साथ माइक्रोस्कोप के नीचे सीधे गिनती करना सूक्ष्मजीवों की गिनती के लिए आमतौर पर इस्तेमाल की जाने वाली विधि है। काउंटिंग प्लेट एक विशेष ग्लास स्लाइड है, जिस पर चार स्लॉट द्वारा तीन प्लेटफॉर्म बनाए जाते हैं; बीच में व्यापक मंच एक छोटे अनुप्रस्थ स्लॉट द्वारा दो हिस्सों में बांटा गया है, और मंच के प्रत्येक तरफ एक ग्रिड है। प्रत्येक ग्रिड नौ बड़े वर्गों में बांटा गया है, और बीच में बड़ा वर्ग मतगणना कक्ष है। रक्त कोशिका काउंटिंग प्लेट की संरचना को चित्र l {{{{10}}}} में दिखाया गया है। मतगणना कक्ष के पैमाने में आम तौर पर दो विनिर्देश होते हैं, एक बड़ा वर्ग होता है जिसे 25 मध्य वर्गों में विभाजित किया जाता है, और प्रत्येक मध्य वर्ग को 16 छोटे वर्गों में विभाजित किया जाता है (चित्र 15-2); दूसरा एक बड़ा वर्ग है। वर्ग को 16 मध्य वर्गों में विभाजित किया गया है, और प्रत्येक मध्य वर्ग को 25 छोटे वर्गों में विभाजित किया गया है, लेकिन इससे कोई फर्क नहीं पड़ता कि यह किस प्रकार का मतगणना बोर्ड है, प्रत्येक बड़े वर्ग में 400 छोटे वर्ग हैं। प्रत्येक बड़े वर्ग की भुजा की लंबाई 1 मिमी है, और प्रत्येक बड़े वर्ग का क्षेत्रफल 1 मिमी2 है। कवर ग्लास के साथ कवर करने के बाद, कवर ग्लास और स्लाइड ग्लास के बीच की ऊंचाई 0.1 मिमी है, इसलिए गिनती कक्ष की मात्रा 0.lmm3 (मिलीलीटर का एक हजारवां) है। चित्र 15-1 रक्त कोशिका गणना बोर्ड की संरचना (1) चित्र 15-2 रक्त कोशिका गणना बोर्ड की संरचना (2) A. सामने का दृश्य; बी अनुदैर्ध्य खंड दृश्य; बढ़े हुए ग्रिड, बीच में बड़ा वर्ग गिनती कक्ष है 1. रक्त कोशिकाओं की गिनती प्लेट; 2. कवर ग्लास; 3. मतगणना कक्ष में गिनती करते समय, आमतौर पर पाँच वर्गों में बैक्टीरिया की कुल संख्या की गणना करें, फिर प्रत्येक वर्ग के औसत की गणना करें, और प्राप्त करने के लिए 25 या 16 से गुणा करें, एक बड़े वर्ग में बैक्टीरिया की कुल संख्या तब में परिवर्तित हो जाती है जीवाणु समाधान के 1 मिलीलीटर में बैक्टीरिया की कुल संख्या। मान लें कि पाँच वर्गों में जीवाणुओं की कुल संख्या A है, और जीवाणु विलयन का तनुकरण अनुपात B है। यदि यह 25 वर्गों के साथ एक गिनती प्लेट है, तो जीवाणु समाधान के 1 एमएल में जीवाणुओं की कुल संख्या {{26} } A/5×25×104× B=50000A·B(टुकड़े) इसी तरह, अगर यह 16 मध्यम वर्गों वाली एक गिनती प्लेट है, तो 1mL जीवाणु समाधान में बैक्टीरिया की कुल संख्या=A/ 5×16×104×B=32000A·B (टुकड़े)
3. उपकरण
1. जीवाणु
Saccharomyces cerevisiae
2. यंत्र या अन्य बर्तन
हेमोसाइटोमीटर, माइक्रोस्कोप, कवरस्लिप, बाँझ केशिका ड्रॉपर।
4. ऑपरेशन के चरण
1. जीवाणु निलंबन की तैयारी
Saccharomyces cerevisiae बाँझ शारीरिक खारा के साथ उचित एकाग्रता के जीवाणु निलंबन में तैयार किया गया था।
2. माइक्रोस्कोप काउंटिंग रूम
नमूने जोड़ने से पहले, गिनती प्लेट के गिनती कक्ष का सूक्ष्म निरीक्षण करें। यदि गंदगी है, तो उसे गिनने से पहले साफ और सुखाया जाना चाहिए।
3. नमूना जोड़ें
एक कवरस्लिप के साथ साफ और सूखे हीमोसाइटोमीटर को कवर करें, और फिर एक बाँझ केशिका ड्रॉपर का उपयोग करके कवरस्लिप के किनारे से हिलाए गए सैक्रोमाइसेस सेरेविसिया निलंबन की एक छोटी बूंद को गिरा दें, और बैक्टीरिया के घोल को केशिका परासरण द्वारा अंतराल के साथ स्वचालित रूप से आगे बढ़ने दें। मतगणना कक्ष में प्रवेश करते हुए, सामान्य मतगणना कक्ष जीवाणु तरल से भरा जा सकता है। नमूना लेते समय, सबसे पहले जीवाणु समाधान को हिलाएं; नमूने जोड़ते समय, मतगणना कक्ष में कोई हवाई बुलबुले उत्पन्न नहीं होने चाहिए।
4. माइक्रोस्कोप की गिनती
नमूना जोड़ने के बाद, 5 मिनट के लिए स्थिर रहें, फिर हीमोसाइटोमीटर को माइक्रोस्कोप चरण पर रखें, पहले कम-शक्ति वाले माइक्रोस्कोप के साथ गिनती कक्ष का स्थान खोजें, और फिर गिनती के लिए एक उच्च-शक्ति माइक्रोस्कोप पर स्विच करें। माइक्रोस्कोप प्रकाश की तीव्रता को उचित रूप से समायोजित करें। प्रकाश के लिए दर्पण का उपयोग करने वाले सूक्ष्मदर्शी के लिए, ध्यान दें कि प्रकाश के एक तरफ से विचलन न करें, अन्यथा मतगणना कक्ष की वर्ग रेखाओं को दृष्टि के क्षेत्र में स्पष्ट रूप से देखना आसान नहीं होगा, या केवल ऊर्ध्वाधर रेखाएँ या क्षैतिज रेखाएँ ही दिखाई देंगी देखा गया। यदि यह पाया जाता है कि गिनती से पहले जीवाणु समाधान बहुत अधिक केंद्रित या बहुत पतला है, तो गिनती से पहले कमजोर पड़ने को ठीक करना आवश्यक है। आम तौर पर, नमूना कमजोर पड़ने के लिए प्रत्येक छोटी कोशिका में लगभग 5 से 10 जीवाणुओं की आवश्यकता होती है। प्रत्येक मतगणना कक्ष मतगणना के लिए 5 मध्य कक्षों (वैकल्पिक 4 कोनों और केंद्र में एक मध्य कक्ष) का चयन करता है। ग्रिड लाइन पर स्थित कोशिकाओं को आम तौर पर केवल ऊपरी और दाहिनी रेखाओं पर गिना जाता है। खमीर मुकुलन के मामले में, जब कली का आकार मातृ कोशिका के आधे हिस्से तक पहुँच जाता है, तो इसे दो जीवाणु कोशिकाओं के रूप में गिना जाता है। एक नमूने की गणना करने के लिए, दो गिनती कक्षों से औसत मूल्य की गणना करके नमूने की जीवाणु सामग्री की गणना करें।
5. ब्लड सेल काउंट को धोएं
उपयोग के बाद, नल में पानी के साथ रक्त कोशिका गिनती बोर्ड को कुल्लाएं, कठोर वस्तुओं से साफ़ न करें, और धोने के बाद इसे स्वयं या हेयर ड्रायर से सुखाएं। माइक्रोस्कोपिक परीक्षा यह देखने के लिए कि प्रत्येक छोटी कोशिका में अवशिष्ट बैक्टीरिया या अन्य तलछट हैं या नहीं। यदि यह साफ नहीं है, तो इसे साफ होने तक बार-बार धोना चाहिए।
