प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी और पारंपरिक ऑप्टिकल सूक्ष्मदर्शी की तुलना और विशेषताएं
एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी एक साधारण ऑप्टिकल सूक्ष्मदर्शी से भिन्न होता है। पारंपरिक प्रकाश स्रोत से रोशनी के तहत नमूनों का अवलोकन करने के बजाय, यह नमूने के भीतर फ्लोरोसेंट पदार्थों को उत्तेजित करने के लिए एक विशिष्ट तरंग दैर्ध्य (आमतौर पर पराबैंगनी या नीली-बैंगनी प्रकाश) के प्रकाश का उपयोग करता है, जिससे वे प्रतिदीप्ति उत्सर्जित करते हैं। इसलिए, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का प्रकाश स्रोत प्रत्यक्ष रोशनी के लिए काम नहीं करता है; यह नमूने में अंतर्जात फ्लोरोसेंट पदार्थों को उत्तेजित करने के लिए एक ऊर्जा स्रोत के रूप में कार्य करता है। हम स्रोत से प्रकाश के कारण नहीं, बल्कि उत्तेजना प्रकाश को अवशोषित करने के बाद नमूने में फ्लोरोसेंट पदार्थों द्वारा उत्सर्जित प्रतिदीप्ति के कारण नमूने का निरीक्षण करने में सक्षम हैं।
यह इस प्रकार है कि प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप की मुख्य विशेषता इसका प्रकाश स्रोत है, जो परीक्षण नमूने में फ्लोरोसेंट पदार्थों के लिए पर्याप्त उत्तेजना तीव्रता प्रदान करने के लिए एक विशिष्ट तरंग दैर्ध्य सीमा के भीतर प्रचुर उत्तेजना प्रकाश की आपूर्ति कर सकता है। इस बीच, एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप को संबंधित फ़िल्टर सिस्टम से सुसज्जित किया जाना चाहिए। प्रतिदीप्ति हिस्टोकैमिस्ट्री के लिए एक आवश्यक उपकरण के रूप में, इसमें मुख्य रूप से एक अति-उच्च दबाव प्रकाश स्रोत, एक फिल्टर सेट (उत्तेजना फिल्टर और बाधा फिल्टर सहित), एक ऑप्टिकल प्रणाली और एक फोटोग्राफिक प्रणाली शामिल है। यह प्रतिदीप्ति उत्पन्न करने के लिए एक निश्चित तरंग दैर्ध्य के प्रकाश के साथ रोमांचक नमूनों द्वारा काम करता है।
प्रतिदीप्ति उत्तेजना विधियाँ: तरंग दैर्ध्य रेंज द्वारा यूवी उत्तेजना (पराबैंगनी रोशनी विधि) और बीवी उत्तेजना (नीली-बैंगनी प्रकाश विधि) में वर्गीकृत। यूवी उत्तेजना उत्तेजना के लिए 400 एनएम से कम पराबैंगनी प्रकाश का उपयोग करती है। कोई दृश्य उत्तेजना प्रकाश शामिल नहीं है, इसलिए देखी गई प्रतिदीप्ति डाई की अंतर्निहित प्रतिदीप्ति को दर्शाती है। इससे नमूने पर विशिष्ट प्रतिदीप्ति को पृष्ठभूमि ऊतक के ऑटोफ्लोरेसेंस से अलग करना आसान हो जाता है।
बीवी उत्तेजना विधि: उत्तेजना पराबैंगनी से लेकर नीली रोशनी तक की रोशनी के साथ की जाती है, जो 404 एनएम और 434 एनएम पर केंद्रित होती है। चूंकि इस विधि में नीली रोशनी नमूने को विकिरणित करती है, इसलिए प्रतिदीप्ति अवलोकन प्रणाली के कट-ऑफ फिल्टर को आवश्यक हरे और पीले प्रतिदीप्ति को पूरी तरह से प्रसारित करते हुए नीली रोशनी को पूरी तरह से अवरुद्ध करना होगा। यह विधि फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी तकनीकों में उपयोग किए जाने वाले फ्लोरोक्रोम पर लागू होती है। उत्तेजना प्रकाश की अधिकतम अवशोषण तरंग दैर्ध्य और प्रतिदीप्ति की अधिकतम उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य अपेक्षाकृत करीब हैं, इसलिए बीवी उत्तेजना के लिए तेज-कट फिल्टर की आवश्यकता होती है। नीली रोशनी का उपयोग यहां उत्तेजना प्रकाश के रूप में किया जाता है, जो फ्लोरोक्रोम की उच्च अवशोषण दक्षता लाता है और उज्जवल छवियां देता है। इसका दोष यह है कि 500 एनएम से नीचे प्रतिदीप्ति का पता नहीं लगाया जा सकता है, और 500 एनएम से ऊपर के संकेत पूरी छवि को पीला रंग देते हैं। फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी परीक्षण में, विशिष्टता को ज्यादातर फ्लोरोक्रोम के विशिष्ट रंग से आंका जाता है। इसलिए, सूक्ष्म विशिष्टता का मूल्यांकन करते समय, बीवी उत्तेजना विधि के उपरोक्त नुकसान का महत्वपूर्ण प्रभाव हो सकता है।
