प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का सिद्धांत और निर्माण
प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप एक उच्च चमकदार दक्षता बिंदु प्रकाश स्रोत का उपयोग करता है, जो उत्तेजना प्रकाश के रूप में रंग फ़िल्टरिंग प्रणाली के माध्यम से प्रकाश की एक निश्चित तरंग दैर्ध्य (जैसे पराबैंगनी प्रकाश 3650 इंच या बैंगनी नीली रोशनी 4200 इंच) उत्सर्जित करता है, और नमूने में फ्लोरोसेंट पदार्थों को उत्तेजित करता है प्रतिदीप्ति के विभिन्न रंगों का उत्सर्जन करें। उसके बाद अभिदृश्यक और नेत्रिका को आवर्धित करके देखा जाता है। इस तरह, कमजोर प्रतिदीप्ति के साथ भी, यह आसानी से पहचानने योग्य है और मजबूत विपरीत पृष्ठभूमि के तहत अत्यधिक संवेदनशील है, जिसका उपयोग मुख्य रूप से कोशिका संरचना और कार्य, साथ ही रासायनिक संरचना का अध्ययन करने के लिए किया जाता है। प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप की मूल संरचना एक साधारण ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप और कुछ सहायक उपकरण (जैसे फ्लोरोसेंट प्रकाश स्रोत, उत्तेजना फिल्टर, बाइक्रोमैटिक बीम विभाजक, और अवरुद्ध फिल्टर इत्यादि) से बनी होती है। फ्लोरोसेंट प्रकाश स्रोत - आमतौर पर अल्ट्रा-हाई प्रेशर पारा लैंप (50-200W) का उपयोग करते हैं, जो विभिन्न तरंग दैर्ध्य का प्रकाश उत्सर्जित कर सकते हैं। हालाँकि, प्रत्येक फ्लोरोसेंट पदार्थ में एक उत्तेजना प्रकाश तरंग दैर्ध्य होता है जो सबसे मजबूत प्रतिदीप्ति उत्पन्न करता है, इसलिए उत्तेजना प्रकाश की केवल एक निश्चित तरंग दैर्ध्य को गुजरने और रोशन करने की अनुमति देने के लिए उत्तेजना फिल्टर (आमतौर पर पराबैंगनी, बैंगनी, नीला और हरा उत्तेजना फिल्टर) को जोड़ने की आवश्यकता होती है। नमूना, अन्य सभी प्रकाश को अवशोषित करते हुए। उत्तेजित प्रकाश से विकिरणित होने के बाद, प्रत्येक पदार्थ बहुत कम समय में विकिरण की तुलना में लंबी तरंग दैर्ध्य के साथ दृश्यमान प्रतिदीप्ति उत्सर्जित करता है। प्रतिदीप्ति में विशिष्टता होती है और यह आमतौर पर उत्तेजना प्रकाश से कमजोर होती है। विशिष्ट प्रतिदीप्ति का निरीक्षण करने के लिए, ऑब्जेक्टिव लेंस के पीछे एक अवरुद्ध (या दबाने वाला) फ़िल्टर जोड़ने की आवश्यकता होती है। इसके दो कार्य हैं: सबसे पहले, यह प्रतिदीप्ति को परेशान करने और आंखों को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए उत्तेजना प्रकाश को ऐपिस में प्रवेश करने से रोकता है और रोकता है; दूसरे, यह एक विशिष्ट प्रतिदीप्ति रंग प्रदर्शित करते हुए विशिष्ट प्रतिदीप्ति का चयन करता है और उसे गुजरने की अनुमति देता है। एक साथ उपयोग के लिए दोनों प्रकार के फ़िल्टर का चयन किया जाना चाहिए।
उनके ऑप्टिकल पथ के आधार पर प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी दो प्रकार के होते हैं:
1. ट्रांसमिशन प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप: प्रतिदीप्ति को उत्तेजित करने के लिए उत्तेजना प्रकाश स्रोत को एक कंडेनसर के माध्यम से नमूना सामग्री के माध्यम से प्रेषित किया जाता है। आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले डार्क फील्ड लाइट कलेक्टर, या साधारण लाइट कलेक्टर, का उपयोग नमूने पर उत्तेजना प्रकाश और साइड लाइट को परिवर्तित करने के लिए परावर्तक को समायोजित करने के लिए किया जा सकता है। यह अपेक्षाकृत पुराने ज़माने का प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी है। इसका लाभ यह है कि प्रतिदीप्ति कम आवर्धन पर मजबूत होती है, जबकि इसका नुकसान यह है कि आवर्धन बढ़ने पर प्रतिदीप्ति कमजोर हो जाती है। इसलिए, बड़े नमूना सामग्रियों का अवलोकन करना बेहतर है।
2. फॉलिंग बीम प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी यह आधुनिक समय में विकसित एक नए प्रकार का प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी है। पिछले वाले के विपरीत, उत्तेजना प्रकाश वस्तुनिष्ठ लेंस से नमूने की सतह तक गिरता है, प्रतिदीप्ति एकत्र करने के लिए रोशनी कंडेनसर और वस्तुनिष्ठ लेंस के समान वस्तुनिष्ठ लेंस का उपयोग करता है। ऑप्टिकल पथ में एक दोहरे रंग बीम विभाजक को जोड़ने की आवश्यकता है, जो प्रकाश यूरेनियम से 45 डिग्री के कोण पर है। उत्तेजना प्रकाश वस्तुनिष्ठ लेंस में परावर्तित होता है और नमूने पर केंद्रित होता है। नमूने द्वारा उत्पन्न प्रतिदीप्ति, साथ ही उद्देश्य लेंस और कवर ग्लास की सतह से परावर्तित उत्तेजना प्रकाश, एक साथ उद्देश्य लेंस में प्रवेश करते हैं और उत्तेजना और प्रतिदीप्ति को अलग करते हुए डाइक्रोइक बीम विभाजक पर लौट आते हैं। फिर अवशिष्ट उत्तेजना को अवरोधक फ़िल्टर द्वारा अवशोषित कर लिया जाता है। यदि विभिन्न उत्तेजना फिल्टर/दोहरे रंग बीम विभाजक/अवरुद्ध फिल्टर संयोजन का उपयोग किया जाता है, तो वे विभिन्न फ्लोरोसेंट प्रतिक्रिया उत्पादों की जरूरतों को पूरा कर सकते हैं। इस फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का लाभ यह है कि दृष्टि रोशनी का क्षेत्र एक समान है, इमेजिंग स्पष्ट है, और आवर्धन जितना बड़ा होगा, प्रतिदीप्ति उतनी ही मजबूत होगी।
