दो-फोटोन प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के कई लाभ हैं:
1) नमूने को भेदने के लिए प्रकाश की लम्बी तरंगदैर्घ्य, छोटी तरंगदैर्घ्य की तुलना में प्रकीर्णन से कम प्रभावित होती हैं;
(2) फोकल प्लेन के बाहर फ्लोरोसेंट अणु उत्तेजित नहीं होते हैं ताकि अधिक उत्तेजना प्रकाश फोकल प्लेन तक पहुंच सके, ताकि उत्तेजना प्रकाश नमूने में गहराई से प्रवेश कर सके;
3) निकट-अवरक्त प्रकाश की लम्बी तरंगदैर्घ्य, छोटी तरंगदैर्घ्य की तुलना में कोशिकाओं के लिए कम विषाक्त होती हैं;
4) जब किसी नमूने का निरीक्षण करने के लिए दो-फ़ोटॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग किया जाता है, तो फोटोब्लीचिंग और फोटोटॉक्सिसिटी केवल फ़ोकल प्लेन पर मौजूद होती है। इसलिए, मोटे नमूनों का निरीक्षण करने, जीवित कोशिकाओं का निरीक्षण करने या स्पॉट फोटोब्लीचिंग प्रयोग करने के लिए दो-फ़ोटॉन माइक्रोस्कोप एकल-फ़ोटॉन माइक्रोस्कोप की तुलना में अधिक उपयुक्त होते हैं।
कॉन्फोकल फ्लोरोसेंस माइक्रोस्कोप ज्ञान
कॉन्फ़ोकल प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी का मूल सिद्धांत: नमूने को विकिरणित करने के लिए एक बिंदु प्रकाश स्रोत का उपयोग किया जाता है, जो फ़ोकल तल पर प्रकाश का एक छोटा, अच्छी तरह से परिभाषित बिंदु बनाता है। विकिरण के बाद इस बिंदु से उत्सर्जित प्रतिदीप्ति को ऑब्जेक्टिव लेंस द्वारा एकत्र किया जाता है और मूल विकिरण प्रकाश पथ के साथ द्वि-दिशात्मक रंगीन दर्पण से युक्त बीमस्प्लिटर में वापस भेजा जाता है। बीम स्प्लिटर प्रतिदीप्ति को सीधे डिटेक्टर को भेजता है। प्रकाश स्रोत और डिटेक्टर दोनों के सामने एक पिनहोल होता है, जिसे क्रमशः रोशनी पिनहोल और डिटेक्शन पिनहोल कहा जाता है। दोनों की ज्यामिति समान होती है, लगभग 100-200 एनएम, और फ़ोकल तल पर प्रकाश के बिंदु के संबंध में संयुग्मित होते हैं, यानी, प्रकाश का बिंदु लेंस की एक श्रृंखला से होकर गुजरता है और अंततः रोशनी और डिटेक्टर दोनों पिनहोल पर केंद्रित हो सकता है। इस तरह, फ़ोकल तल से प्रकाश जांच एपर्चर के भीतर अभिसरित हो सकता है, जबकि फ़ोकल तल के ऊपर या नीचे से बिखरा हुआ प्रकाश जांच एपर्चर के बाहर अवरुद्ध हो जाता है और उसकी छवि नहीं बनाई जा सकती है। लेजर नमूने को बिंदु दर बिंदु स्कैन करता है, और फोटोमल्टीप्लायर ट्यूब पिनहोल का पता लगाने के बाद बिंदु दर बिंदु संबंधित प्रकाश बिंदु की कन्फोकल छवि भी प्राप्त करता है, जिसे डिजिटल सिग्नल में परिवर्तित करके कंप्यूटर को प्रेषित किया जाता है, और अंत में स्क्रीन पर संपूर्ण फोकल प्लेन की स्पष्ट कन्फोकल छवि में परिवर्तित कर दिया जाता है।
प्रत्येक फोकल प्लेन इमेज वास्तव में नमूने का एक ऑप्टिकल क्रॉस-सेक्शन है, और इस ऑप्टिकल क्रॉस-सेक्शन में हमेशा एक निश्चित मोटाई होती है, जिसे ऑप्टिकल शीट भी कहा जाता है। चूंकि फोकल बिंदु पर प्रकाश की तीव्रता गैर-फोकल बिंदु की तुलना में बहुत अधिक होती है, और गैर-फोकल प्लेन प्रकाश को पिनहोल द्वारा फ़िल्टर किया जाता है, इसलिए कॉन्फोकल सिस्टम के क्षेत्र की गहराई शून्य होने का अनुमान है, और Z-अक्ष दिशा के साथ स्कैनिंग ऑप्टिकल टोमोग्राफी को फोकल स्पॉट पर देखे जाने वाले नमूने का दो-आयामी ऑप्टिकल स्लाइस बनाने में सक्षम बनाती है। XY प्लेन (फोकल प्लेन) स्कैनिंग को Z-अक्ष (ऑप्टिकल अक्ष) स्कैनिंग के साथ मिलाकर, दो-आयामी छवियों की क्रमिक परतों को जमा करके नमूने की एक त्रि-आयामी छवि प्राप्त की जा सकती है, जिसे विशेष कंप्यूटर सॉफ़्टवेयर द्वारा संसाधित किया जाता है।
इसका अर्थ यह है कि संसूचन पिनहोल और प्रकाश स्रोत पिनहोल हमेशा एक ही बिंदु पर केंद्रित होते हैं, ताकि फोकल तल के बाहर उत्तेजित प्रतिदीप्ति संसूचन पिनहोल में प्रवेश न कर सके।
लेजर कन्फोकल का कार्य सिद्धांत बस व्यक्त किया जाता है कि यह पारंपरिक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप इमेजिंग, अतिरिक्त लेजर स्कैनिंग डिवाइस और संयुग्म फोकसिंग डिवाइस के आधार पर, कंप्यूटर नियंत्रण के माध्यम से डिजिटल छवि अधिग्रहण और प्रसंस्करण प्रणाली को पूरा करने के लिए एक प्रकाश स्रोत के रूप में लेजर का उपयोग करता है।
