ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप की मुख्य अवलोकन विधि प्रतिदीप्ति अवलोकन है
प्रतिदीप्ति उस प्रक्रिया को संदर्भित करती है जिसमें एक फ्लोरोसेंट पदार्थ लगभग एक साथ लंबी तरंग दैर्ध्य के साथ प्रकाश उत्सर्जित करता है जब इसे एक विशिष्ट तरंग दैर्ध्य (चित्र 1) के प्रकाश से विकिरणित किया जाता है। जब एक विशिष्ट तरंग दैर्ध्य (उत्तेजना तरंग दैर्ध्य) का प्रकाश एक अणु से टकराता है, जैसे कि फ्लोरोफोर में, तो फोटॉन ऊर्जा अणु के इलेक्ट्रॉनों द्वारा अवशोषित हो जाती है। इसके बाद, इलेक्ट्रॉन जमीनी अवस्था (S0) से उच्च ऊर्जा स्तर, उत्तेजित अवस्था (S1') में परिवर्तित हो जाते हैं। इस प्रक्रिया को उत्तेजना① कहा जाता है। इलेक्ट्रॉन उत्तेजित अवस्था में 10-9–10-8 सेकंड तक रहता है, जिसके दौरान इलेक्ट्रॉन कुछ ऊर्जा खो देता है②। इलेक्ट्रॉनों की उत्तेजित अवस्था (S1) को छोड़ने और जमीनी अवस्था में लौटने की प्रक्रिया के दौरान, उत्तेजना प्रक्रिया के दौरान अवशोषित शेष ऊर्जा निकल जाती है।
उत्तेजित अवस्था में फ्लोरोसेंट अणु का निवास समय प्रतिदीप्ति जीवनकाल है, जो आम तौर पर नैनोसेकंड स्तर पर होता है, और फ्लोरोसेंट अणु की एक अंतर्निहित विशेषता है। प्रतिदीप्ति लाइफटाइम इमेजिंग (FLIM), जो प्रतिदीप्ति लाइफटाइम इमेजिंग तकनीक का उपयोग करती है, को प्रतिदीप्ति लाइफटाइम इमेजिंग (FLIM) कहा जाता है। प्रतिदीप्ति तीव्रता इमेजिंग के अलावा, आणविक संरचना, अंतर-आणविक इंटरैक्शन और अणुओं के सूक्ष्म वातावरण को प्राप्त करने के लिए अधिक गहन कार्यात्मक और सटीक माप प्राप्त किए जा सकते हैं। ऐसी जानकारी जिसे पारंपरिक ऑप्टिकल इमेजिंग से प्राप्त करना कठिन है।
प्रतिदीप्ति का एक अन्य महत्वपूर्ण गुण स्टोक्स शिफ्ट है, उत्तेजना और उत्सर्जन शिखर के बीच तरंग दैर्ध्य में अंतर (चित्रा 2)। आमतौर पर उत्सर्जन तरंगदैर्घ्य उत्तेजना तरंगदैर्घ्य से अधिक लंबा होता है। ऐसा इसलिए है क्योंकि फ्लोरोसेंट पदार्थ के उत्तेजित होने के बाद और फोटॉन जारी करने से पहले विश्राम प्रक्रिया के माध्यम से इलेक्ट्रॉन अपनी ऊर्जा का कुछ हिस्सा खो देंगे। बड़े स्टोक्स शिफ्ट वाले फ्लोरोसेंट पदार्थों को फ्लोरोसेंस माइक्रोस्कोप के तहत देखना आसान होता है।
प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और प्रतिदीप्ति फ़िल्टर क्यूब्स
प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप है जो अवलोकन और इमेजिंग के लिए प्रतिदीप्ति गुणों का उपयोग करता है, और कोशिका जीव विज्ञान, तंत्रिका जीव विज्ञान, वनस्पति विज्ञान, सूक्ष्म जीव विज्ञान, विकृति विज्ञान और आनुवंशिकी जैसे विभिन्न क्षेत्रों में व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। प्रतिदीप्ति इमेजिंग में उच्च संवेदनशीलता और उच्च विशिष्टता के फायदे हैं, और यह ऊतकों और कोशिकाओं में विशिष्ट प्रोटीन और ऑर्गेनेल के वितरण के अवलोकन, कोलोकलाइज़ेशन और इंटरैक्शन के अध्ययन, आयन एकाग्रता परिवर्तन जैसी जीवन गतिशील प्रक्रियाओं की ट्रैकिंग के लिए बहुत उपयुक्त है। , वगैरह।
कोशिकाओं में अधिकांश अणु प्रतिदीप्त नहीं होते हैं, और उन्हें देखने के लिए उन्हें प्रतिदीप्त रूप से लेबल किया जाना चाहिए। फ्लोरोसेंट लेबलिंग के कई तरीके हैं, जैसे प्रत्यक्ष लेबलिंग (जैसे डीएनए को लेबल करने के लिए डीएपीआई का उपयोग करना), या एंटीबॉडी के एंटीजन-बाइंडिंग गुणों का उपयोग करके इम्यूनोस्टेनिंग, या लक्ष्य प्रोटीन को लेबल करने के लिए फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जैसे जीएफपी, ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन) का उपयोग करना। , और प्रतिवर्ती बंधन। सिंथेटिक रंग (जैसे फ़्यूरा-2) इत्यादि।
वर्तमान में, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप विभिन्न प्रयोगशालाओं और इमेजिंग प्लेटफार्मों का मानक इमेजिंग उपकरण बन गया है, और हमारे दैनिक प्रयोगों के लिए एक अच्छा सहायक है। प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी को मुख्य रूप से तीन श्रेणियों में विभाजित किया जाता है: ईमानदार प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी (टुकड़े करने के लिए उपयुक्त), उल्टे प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी (टुकड़े करने को ध्यान में रखते हुए जीवित कोशिकाओं के लिए उपयुक्त), फ्लोरोसेंट स्टीरियोस्कोप (बड़े नमूनों के लिए उपयुक्त, जैसे कि पौधे, जेब्राफिश (वयस्क/भ्रूण) ) , मेडका, माउस/चूहे के अंग, आदि)।
प्रतिदीप्ति फ़िल्टर ब्लॉक माइक्रोस्कोप प्रतिदीप्ति इमेजिंग का मुख्य घटक है। इसमें तीन भाग होते हैं: उत्तेजना फ़िल्टर, उत्सर्जन फ़िल्टर और डाइक्रोइक बीम स्प्लिटर। इसे फिल्टर व्हील में स्थापित किया गया है। उदाहरण के लिए, Leica DMi8 एक 6-पोजीशन फ़िल्टर व्हील (चित्र 3) से सुसज्जित है। विभिन्न माइक्रोस्कोप पहियों की स्थिति की संख्या अलग-अलग होगी, और कुछ माइक्रोस्कोप फ़िल्टर ब्लॉक स्लाइड का उपयोग करते हैं।
फ़िल्टर ब्लॉक प्रतिदीप्ति इमेजिंग में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है: उत्तेजना फ़िल्टर नमूने को उत्तेजित करने के लिए उत्तेजना प्रकाश का चयन करता है, और अन्य तरंग दैर्ध्य के प्रकाश को अवरुद्ध करता है; उत्तेजना फिल्टर से गुजरने वाली रोशनी डाइक्रोइक दर्पण से होकर गुजरती है (इसका कार्य उत्तेजना प्रकाश को प्रतिबिंबित करना और प्रतिदीप्ति संचारित करना है), परावर्तन के बाद, यह उद्देश्य लेंस द्वारा केंद्रित होता है, नमूना को विकिरणित करता है, और संबंधित प्रतिदीप्ति को उत्तेजित करता है, अर्थात , उत्सर्जित प्रकाश। उत्सर्जित प्रकाश को ऑब्जेक्टिव लेंस द्वारा एकत्र किया जाता है, डाइक्रोइक बीम स्प्लिटर से गुजरता है, और उत्सर्जन फिल्टर तक पहुंचता है। जैसा कि चित्र 4 में दिखाया गया है: उत्तेजना तरंग दैर्ध्य 450-490nm है, डाइक्रोइक दर्पण 510nm से कम प्रकाश को प्रतिबिंबित करता है, 510nm से अधिक लंबे प्रकाश को प्रसारित करता है, और उत्सर्जित प्रकाश की प्राप्त सीमा 520-560nm है।
