दो-फोटॉन प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप की तकनीकी विशेषताएं और उपयोग कौशल
दो-फोटॉन प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी एक नई तकनीक है जो लेजर स्कैनिंग कन्फोकल माइक्रोस्कोपी और दो-फोटॉन उत्तेजना तकनीक को जोड़ती है।
दो-फोटॉन उत्तेजना का मूल सिद्धांत है: उच्च फोटॉन घनत्व के मामले में, फ्लोरोसेंट अणु एक ही समय में दो लंबी-तरंग दैर्ध्य फोटॉन को अवशोषित कर सकते हैं, और तथाकथित उत्तेजित अवस्था जीवनकाल की एक छोटी अवधि के बाद एक छोटी-तरंग दैर्ध्य फोटॉन का उत्सर्जन कर सकते हैं। . ; इसका प्रभाव एक फ्लोरोसेंट अणु को उत्तेजित करने के लिए लंबी तरंग दैर्ध्य के आधे तरंग दैर्ध्य वाले फोटॉन का उपयोग करने जैसा ही है। दो-फोटॉन उत्तेजना के लिए उच्च फोटॉन घनत्व की आवश्यकता होती है। कोशिकाओं को नुकसान न पहुँचाने के लिए, दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी उच्च-ऊर्जा मोड-लॉक स्पंदित लेजर का उपयोग करती है। इस लेजर द्वारा उत्सर्जित लेजर में उच्च शिखर ऊर्जा और कम औसत ऊर्जा होती है, इसकी पल्स चौड़ाई केवल 100 फेमटोसेकंड होती है, और इसकी अवधि 80 से 100 मेगाहर्ट्ज़ तक पहुंच सकती है। स्पंदित लेजर के फोटॉनों पर ध्यान केंद्रित करने के लिए उच्च संख्यात्मक एपर्चर ऑब्जेक्टिव लेंस का उपयोग करते समय, ऑब्जेक्टिव लेंस के फोकल बिंदु पर फोटॉन घनत्व सबसे अधिक होता है, और दो-फोटॉन उत्तेजना केवल ऑब्जेक्टिव लेंस के फोकल बिंदु पर होती है, इसलिए दो-फोटॉन माइक्रोस्कोप को कन्फोकल पिनहोल की आवश्यकता नहीं होती है, जो प्रतिदीप्ति पहचान दक्षता में सुधार करती है। यह आकृति विज्ञान, आणविक कोशिका जीव विज्ञान, तंत्रिका विज्ञान और औषध विज्ञान के क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण अनुसंधान पद्धति है।
1. दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी के उद्भव की पृष्ठभूमि - पारंपरिक लेजर कन्फोकल माइक्रोस्कोपी की दो सीमाएँ:
1) एक फोटोटॉक्सिसिटी घटना है: क्योंकि उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवि प्राप्त करने के लिए कन्फोकल पिनहोल काफी छोटा होना चाहिए, और छोटा एपर्चर नमूने से उत्सर्जित प्रतिदीप्ति के एक बड़े हिस्से को अवरुद्ध कर देगा, जिसमें फोकल विमान से उत्सर्जित प्रतिदीप्ति भी शामिल है, संगत हां, पर्याप्त सिग्नल-टू-शोर अनुपात प्राप्त करने के लिए उत्तेजना प्रकाश पर्याप्त मजबूत होना चाहिए; और उच्च तीव्रता वाले लेजर के कारण निरंतर स्कैनिंग के दौरान फ्लोरोसेंट डाई तेजी से फीकी पड़ जाएगी, और जैसे-जैसे स्कैनिंग आगे बढ़ेगी फ्लोरोसेंट सिग्नल कमजोर और कमजोर होता जाएगा।
2) फोटोटॉक्सिसिटी एक और समस्या है। लेजर विकिरण के तहत, कई फ्लोरोसेंट डाई अणु सिंगलेट ऑक्सीजन या मुक्त कणों जैसे साइटोटॉक्सिन का उत्पादन करेंगे, इसलिए नमूना घनत्व को बनाए रखने के लिए स्कैनिंग समय और उत्तेजना प्रकाश की ऑप्टिकल पावर घनत्व प्रयोग में सीमित होनी चाहिए। सक्रिय। सक्रिय नमूनों पर शोध में, विशेष रूप से सक्रिय नमूनों की वृद्धि और विकास के विभिन्न चरण, फोटोब्लीचिंग और फोटोटॉक्सिसिटी इन अध्ययनों को बहुत सीमित बनाते हैं।
2. आप ऐसा क्यों कहते हैं कि दो-फोटॉन सूक्ष्मदर्शी को आम तौर पर पराबैंगनी उत्तेजना लेजर से सुसज्जित करने की आवश्यकता नहीं होती है?
दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी दो-फोटॉन उत्तेजना प्रभाव पर आधारित एक प्रतिदीप्ति उत्तेजना तकनीक है: फ्लोरोसेंट डाई अणुओं को एक ही समय में दो कम ऊर्जा वाले फोटॉन को अवशोषित करके उत्तेजित किया जा सकता है (फ्लोरोसेंट अणुओं तक पहुंचने वाले दो फोटॉन के बीच का समय अंतराल 1 फेमटोसेकंड से कम है) ), इसका उत्तेजना प्रभाव 1/2 तरंग दैर्ध्य के उच्च-ऊर्जा फोटॉन को अवशोषित करने के बराबर हो सकता है। उदाहरण के लिए, लाल तरंग दैर्ध्य पर दो फोटॉन को अवशोषित करना एक अणु द्वारा पराबैंगनी को अवशोषित करने के बराबर है। लंबी-तरंगदैर्ध्य फोटॉन कोशिकाओं द्वारा आसानी से अवशोषित नहीं होते हैं, इसलिए जीवित कोशिकाओं में फोटोटॉक्सिसिटी कम हो जाती है, और फोटोब्लीचिंग भी कम हो जाती है। इस तरह, यह न केवल पराबैंगनी उत्तेजना का कार्य करता है, बल्कि नमूने को पराबैंगनी प्रकाश की क्षति से भी बचाता है।
3. दो-फोटॉन माइक्रोस्कोप के लेजर के बारे में क्या खास है?
दो-फोटॉन अवशोषण की संभावना इस बात पर निर्भर करती है कि दो घटना वाले फोटॉन अंतरिक्ष और समय में कितनी निकटता से मेल खाते हैं (दो फोटॉन को 10-18 सेकंड के भीतर आना चाहिए)। दो-फोटॉन अवशोषण क्रॉस सेक्शन छोटा है, और बड़े फोटॉन फ्लक्स वाले क्षेत्रों में केवल फ्लोरोफोरस उत्तेजित होते हैं। इसलिए, उपयोग किए जाने वाले अधिकांश लेजर टाइटेनियम नीलमणि लेजर हैं, जो पिकोसेकंड या फेमटोसेकंड स्कैनिंग गति प्राप्त कर सकते हैं, और इसमें बहुत अधिक शिखर शक्ति और कम औसत शक्ति होती है, ताकि फोटोब्लीचिंग और फोटोटॉक्सिसिटी को कम या समाप्त किया जा सके। सबसे महत्वपूर्ण बात यह है कि एक छोटी सी सीमा में फोटॉनों का बहुत उच्च घनत्व प्रदान करना है, जो दो फोटॉनों के एक साथ उत्तेजना को सुनिश्चित कर सकता है।
4. दो-फोटॉन उत्तेजना के क्या फायदे हैं?
1) डाई की चयनात्मकता बढ़ाएँ: कन्फोकल सिस्टम लेजर (Ar, Ar/Kr, HeNe) की उत्तेजना प्रकाश सीमा 488nm - 647nm है। इसका मतलब है यूवी-उत्तेजित फ्लोरोसेंट रंगों के साथ प्रयोग करना, उदाहरण के लिए डीएपीआई, होश्च के साथ। दो-फोटॉन की उत्तेजना तरंग दैर्ध्य एकल-फोटॉन की उत्तेजना तरंग दैर्ध्य से दोगुनी होती है, इसलिए पराबैंगनी द्वारा उत्तेजित रंगों को निकट-अवरक्त प्रकाश द्वारा उत्तेजित किया जा सकता है।
2) फोटोब्लीचिंग कम करें: फोटोब्लीचिंग में कमी के कारण, प्रतिदीप्ति अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (एफआरईटी) के लिए सीएफपी/वाईएफपी का उपयोग करने वाले प्रयोगों की सफलता दर बढ़ जाती है।
3) किसी विशेष वस्तुनिष्ठ लेंस की आवश्यकता नहीं है: हार्डवेयर के दृष्टिकोण से, निकट-अवरक्त प्रकाश की तरंग दैर्ध्य के साथ यूवी-उत्तेजित रंगों के उत्तेजना के लिए विशेष यूवी ऑप्टिकल घटकों की आवश्यकता नहीं होती है।
4) सिग्नल-टू-शोर अनुपात में सुधार करें: उत्तेजना प्रकाश तरंग दैर्ध्य और उत्सर्जित प्रकाश तरंग दैर्ध्य में बड़ा अंतर होता है, जो सिग्नल-टू-शोर अनुपात में सुधार करता है।
5) ब्लीचिंग को केंद्र बिंदु पर स्थानीयकृत किया जाता है: चूंकि प्रतिदीप्ति उत्तेजना केवल उद्देश्य के केंद्र बिंदु पर होती है, इसलिए कन्फोकल पिनहोल की कोई आवश्यकता नहीं होती है। इससे प्रकाश पहचान में सुधार होता है और फोटोब्लीचिंग केवल फोकल बिंदु पर होती है।
6) नमूनों में प्रवेश करना आसान: इन्फ्रारेड तरंग दैर्ध्य प्रकाश कोशिकाओं द्वारा आसानी से नहीं फैलता है और गहरे नमूनों में प्रवेश कर सकता है।
5. लेजर स्कैनिंग कन्फोकल माइक्रोस्कोपी की तुलना में, दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा किया गया सबसे बड़ा सुधार क्या है?
1) फोटोब्लीचिंग में कमी।
2) फोटोटॉक्सिसिटी में कमी।
3) इसे बिखेरना आसान नहीं है, और मस्तिष्क के टुकड़ों जैसे मोटे नमूनों को भेदना आसान है।
