सूक्ष्मजीवों का रंग-रोगन तकनीक और सूक्ष्मदर्शी से अवलोकन

सूक्ष्मजीवों का रंग-रोगन तकनीक और सूक्ष्मदर्शी से अवलोकन

1। उद्देश्य

1.1 माइक्रोबियल स्मीयर और स्टेनिंग की मूल तकनीक सीखें।

1.2 बैक्टीरिया की सरल अभिरंजन विधि में निपुणता प्राप्त करें।

1.3 प्रारंभिक रूप से बैक्टीरिया की रूपात्मक विशेषताओं को समझें, और तेल लेंस और एसेप्टिक ऑपरेशन तकनीकों का उपयोग करने के तरीके के ज्ञान को मजबूत करें।

2 सिद्धांत
माइक्रोबायोलॉजी प्रयोगों में बैक्टीरिया को धुंधला करना और रंगना एक बुनियादी तकनीक है। बैक्टीरिया की कोशिकाएँ छोटी और पारदर्शी होती हैं, जिससे उन्हें एक साधारण प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत पहचानना मुश्किल हो जाता है; उन्हें रंगना चाहिए। बैक्टीरिया को रंगने के लिए एक ही डाई का उपयोग किया जाता है, ताकि रंगे हुए बैक्टीरिया पृष्ठभूमि से एक स्पष्ट रंग अंतर बना सकें, ताकि उनकी आकृति विज्ञान और संरचना को अधिक स्पष्ट रूप से देखा जा सके। यह विधि संचालित करने में आसान है और बैक्टीरिया की कोशिकाओं के सामान्य आकार और बैक्टीरिया की व्यवस्था को देखने के लिए उपयुक्त है। बुनियादी रंगों का उपयोग आमतौर पर सरल धुंधलापन के लिए किया जाता है। ऐसा इसलिए है क्योंकि तटस्थ, क्षारीय या कमजोर अम्लीय घोल में, बैक्टीरिया की कोशिकाएँ आमतौर पर नकारात्मक रूप से आवेशित होती हैं, और जब बुनियादी रंगों को आयनित किया जाता है, तो उनके अणुओं का रंगने वाला हिस्सा सकारात्मक रूप से आवेशित होता है, इसलिए वे क्षारीय होते हैं। डाई का धुंधला हिस्सा आसानी से बैक्टीरिया के साथ मिलकर उन्हें रंग देता है। दागदार बैक्टीरिया की कोशिकाएँ पृष्ठभूमि के साथ तेजी से विपरीत होती हैं, जिससे उन्हें माइक्रोस्कोप के नीचे पहचानना आसान हो जाता है। साधारण रंगाई के लिए आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले रंगों में मेथिलीन ब्लू, क्रिस्टल वायलेट, बेसिक फ्यूकसिन आदि शामिल हैं। जब बैक्टीरिया शर्करा को विघटित करते हैं और एसिड बनाते हैं, जिससे कल्चर माध्यम का पीएच गिर जाता है, तो बैक्टीरिया पर सकारात्मक चार्ज बढ़ जाता है। इस समय, ईोसिन, एसिड फ्यूकसिन या कांगो रेड जैसे अम्लीय रंगों का उपयोग धुंधला करने के लिए किया जा सकता है। धुंधला करने से पहले बैक्टीरिया को ठीक किया जाना चाहिए। इसके दो उद्देश्य हैं: एक है बैक्टीरिया को मारना और उन्हें कांच की स्लाइड से चिपकाना; दूसरा है रंगों के लिए उनकी आत्मीयता को बढ़ाना। आमतौर पर इस्तेमाल की जाने वाली दो विधियाँ हैं हीटिंग और रासायनिक निर्धारण। फिक्सिंग करते समय, कोशिकाओं के मूल आकार को बनाए रखने की कोशिश करें।

3 सामग्री

3.1 बैक्टीरिया: बैसिलस सबटिलिस 12-18h पोषक तत्व अगर तिरछा संस्कृति, स्टैफिलोकोकस ऑरियस 24h पोषक तत्व अगर तिरछा संस्कृति, एस्चेरिचिया कोली 24h पोषक तत्व अगर तिरछा संस्कृति, बेकर का खमीर अगर तिरछा संस्कृति।

3.2 रंगाई एजेंट: लू की क्षारीय मेथिलीन ब्लू डाई (या अमोनियम ऑक्सालेट क्रिस्टल वायलेट डाई), कार्बोलिक एसिड फ्यूशिन डाई।

3.3 उपकरण या अन्य बर्तन: माइक्रोस्कोप, अल्कोहल लैंप, स्लाइड, इनोक्यूलेशन लूप, स्लाइड रैक, डबल-लेयर बोतल (देवदार तेल और ज़ाइलीन युक्त), लेंस ऊतक, शारीरिक खारा या आसुत जल, आदि।

4. प्रक्रिया: लेप → सुखाना → स्थिरीकरण → रंगना → धोना → सुखाना → सूक्ष्म परीक्षण।

5 कदम
5.1 स्मियर: दो साफ और तेल रहित ग्लास स्लाइड लें। बाँझ परिस्थितियों में, ग्लास स्लाइड के प्रत्येक केंद्र पर सामान्य खारा (या आसुत जल) की एक छोटी बूंद डालें। बैसिलस सबटिलिस, माइक्रोकॉकस ल्यूटस और एस्चेरिचिया कोली से बैक्टीरिया को बाँझ करने के लिए इनोक्यूलेशन लूप का उपयोग करें, तिरछी पानी की बूंदों में थोड़ा सा बैक्टीरियल लॉन चुनें, अच्छी तरह मिलाएँ और इसे एक पतली फिल्म में लगाएँ। यदि आप बैक्टीरियल सस्पेंशन (या लिक्विड कल्चर) स्मीयर का उपयोग करते हैं, तो आप 2 से 3 लूप लेने के लिए इनोक्यूलेशन लूप का उपयोग कर सकते हैं और उन्हें सीधे स्लाइड पर लगा सकते हैं। सावधान रहें कि बहुत अधिक शारीरिक खारा (आसुत जल) न गिराएँ और बैक्टीरिया को हटा दें और इसे समान रूप से और बहुत मोटा न लगाएँ।

5.2 सुखाना कमरे के तापमान पर प्राकृतिक रूप से सुखाएँ। आप इसे सुखाने के लिए कोटेड साइड को ऊपर की ओर करके अल्कोहल लैंप पर हल्का गर्म भी कर सकते हैं। लेकिन ध्यान रखें कि लौ के बहुत करीब न जाएँ, क्योंकि बहुत ज़्यादा तापमान बैक्टीरिया की आकृति को नष्ट कर देगा।

5.3 स्थिरीकरण यदि गर्म सुखाने का उपयोग किया जाता है, तो स्थिरीकरण और सुखाने को एक चरण में जोड़ दिया जाता है, और विधि सुखाने के समान ही होती है। धब्बा लगाना, सुखाना और गर्म करके स्थिर करना।

5.4 धुंधलापन: स्लाइड को स्लाइड रैक पर सपाट रखें, और स्मीयर पर डाई घोल की 1 से 2 बूंदें डालें (यह उचित है कि डाई घोल स्मीयर फिल्म को पूरी तरह से ढक दे)। 1 से 2 मिनट के लिए लू के बेसिक मेथिलीन ब्लू से रंग दें, और लगभग 1 मिनट के लिए कार्बोलिक एसिड फ्यूकसिन (या अमोनियम ऑक्सालेट क्रिस्टल वायलेट) से रंग दें।

5.5 पानी से धोना: डाई घोल को निकाल दें और स्लाइड के एक सिरे से नल के पानी से धीरे-धीरे तब तक धोएँ जब तक कि धब्बा से नीचे बहने वाला पानी रंगहीन न हो जाए। पानी से धोते समय, लेपित सतह को सीधे पानी से न धोएँ। पानी का बहाव बहुत तेज़ या बहुत ज़्यादा नहीं होना चाहिए ताकि धब्बा फिल्म गिरने से बच जाए।

5.6 सुखाना: स्लाइड पर मौजूद पानी की बूंदों को हिलाकर हटा दें और प्राकृतिक रूप से सुखा लें, हेयर ड्रायर से सुखाएँ या सोखने वाले कागज़ से सोख लें (ध्यान रहे कि बैक्टीरिया न पोंछें)। 5.7 सूक्ष्म परीक्षण धब्बा सूख जाने के बाद, सूक्ष्म परीक्षण करें। तेल लेंस से देखने से पहले धब्बा पूरी तरह से सूख जाना चाहिए।

6 परिणाम एकल अभिरंजन के बाद देखे गए ई. कोली और माइक्रोकॉकस ल्यूटस की आकृति विज्ञान को चित्रित करें।