प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के सिद्धांत
प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी सामान्य ऑप्टिकल सूक्ष्मदर्शी से भिन्न होते हैं। सामान्य प्रकाश स्रोतों की रोशनी में नमूनों का अवलोकन करने के बजाय, वे माइक्रोस्कोप के नीचे नमूनों में फ्लोरोसेंट पदार्थों को उत्तेजित करने के लिए एक निश्चित तरंग दैर्ध्य (आमतौर पर पराबैंगनी प्रकाश, नीली-बैंगनी प्रकाश) के प्रकाश का उपयोग करते हैं ताकि वे प्रतिदीप्ति उत्सर्जित कर सकें। इसलिए, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का प्रकाश स्रोत प्रत्यक्ष रोशनी के रूप में कार्य नहीं करता है, बल्कि एक ऊर्जा स्रोत के रूप में कार्य करता है जो नमूने के भीतर फ्लोरोसेंट पदार्थों को उत्तेजित करता है। जिस कारण से हम नमूने का निरीक्षण कर सकते हैं वह प्रकाश स्रोत की रोशनी के कारण है, लेकिन नमूने में फ्लोरोसेंट पदार्थ उत्तेजित प्रकाश ऊर्जा को अवशोषित करने के बाद प्रस्तुत प्रतिदीप्ति घटना है।
यह देखा जा सकता है कि प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप की विशेषता यह है कि इसका प्रकाश स्रोत एक विशिष्ट तरंग दैर्ध्य रेंज में बड़ी मात्रा में उत्तेजना प्रकाश की आपूर्ति कर सकता है, ताकि परीक्षण किए गए नमूने में फ्लोरोसेंट पदार्थ आवश्यक तीव्रता की उत्तेजना प्रकाश प्राप्त कर सके। उसी समय, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप में संबंधित फ़िल्टर प्रणाली होनी चाहिए।
प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी इम्यूनोफ्लोरेसेंस हिस्टोकैमिस्ट्री में एक आवश्यक उपकरण है। यह अल्ट्रा-हाई-वोल्टेज प्रकाश स्रोत, फिल्टर सिस्टम (उत्तेजना और दमन फिल्टर प्लेट सहित), ऑप्टिकल सिस्टम और फोटोग्राफी सिस्टम और अन्य मुख्य घटकों से बना है। यह प्रतिदीप्ति उत्सर्जित करने के लिए नमूने को उत्तेजित करने के लिए एक निश्चित तरंग दैर्ध्य के प्रकाश का उपयोग करता है।
प्रतिदीप्ति को उत्तेजित करने का तरीका: प्रकाश की तरंग दैर्ध्य सीमा के अनुसार, इसे दो प्रकारों में विभाजित किया जा सकता है: यूवी उत्तेजना विधि (पराबैंगनी प्रकाश विधि का उपयोग करके) और बीवी उत्तेजना विधि (नीले-बैंगनी प्रकाश का उपयोग करके)। यूवी उत्तेजना विधि उत्तेजना के लिए 400 एनएम से कम पराबैंगनी प्रकाश का उपयोग करती है। इस विधि में कोई दृश्य उत्तेजना प्रकाश नहीं है, इसलिए देखी गई प्रतिदीप्ति डाई की अंतर्निहित प्रतिदीप्ति प्रस्तुत करती है, और पृष्ठभूमि ऊतक के ऑटोफ्लोरेसेंस से नमूने पर विशिष्ट प्रतिदीप्ति को अलग करना आसान है।
पराबैंगनी से नीली रोशनी तक उत्तेजना के लिए बीवी उत्तेजना विधि 404nm और 434nm पर आधारित है। यह विधि नमूने को विकिरणित करने के लिए नीली रोशनी का उपयोग करती है, इसलिए प्रतिदीप्ति अवलोकन प्रणाली के कट-ऑफ फिल्टर को एक फिल्टर का उपयोग करना चाहिए जो नीली रोशनी को पूरी तरह से अवरुद्ध कर सकता है और आवश्यक हरे और पीले प्रतिदीप्ति को पूरी तरह से पारित कर सकता है। फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी परीक्षण के लिए फ्लोरोसेंट रंग। उत्तेजना प्रकाश की अधिकतम अवशोषण तरंग दैर्ध्य प्रतिदीप्ति की अधिकतम उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के अपेक्षाकृत करीब है, इसलिए बीवी उत्तेजना विधि में उपयोग किए जाने वाले फिल्टर को एक तेज कट-ऑफ फिल्टर का उपयोग करना चाहिए। यह विधि नीली रोशनी को उत्तेजना प्रकाश के रूप में उपयोग कर सकती है, इसलिए फ्लोरोसेंट वर्णक की अवशोषण दक्षता अधिक होती है, और एक उज्जवल छवि प्राप्त की जा सकती है। इसका नुकसान यह है कि 500nm से नीचे की प्रतिदीप्ति देखी नहीं जा सकती और 500nm से ऊपर की प्रतिदीप्ति पूरी छवि को पीली दिखाई देती है। फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी विधि में, फ्लोरोक्रोम की विशिष्टता को अक्सर फ्लोरोक्रोम के अद्वितीय रंग से आंका जाता है। इसलिए, सूक्ष्म विशिष्टता पर चर्चा करते समय, बीवी उत्तेजना विधि की उपर्युक्त कमियों का अक्सर बहुत प्रभाव पड़ता है।
संक्षेप में, कंडेनसर की संरचना और उत्तेजना प्रकाश की तरंग दैर्ध्य के अनुसार प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप की रोशनी को निम्नलिखित तीन बिंदुओं के अनुसार माना जा सकता है।
① फ्लोरोसेंट छवि की कंट्रास्ट आवश्यकताओं के परिप्रेक्ष्य से, यूवी उत्तेजना डार्क फील्ड कंसंट्रेटर का उपयोग रोशनी के लिए किया जाता है।
② छवि की चमक को ध्यान में रखते हुए, बीवी उत्तेजना फिल्टर में उच्चतम डार्क फील्ड अवलोकन दक्षता है।
③यूवी उत्तेजना फिल्टर डार्क फील्ड अवलोकन और बीवी उत्तेजना डार्क फील्ड कंसंट्रेटर रोशनी की विशेषताओं को इन दो रोशनी विधियों के बीच माना जा सकता है, लेकिन पूर्व में मजबूत डार्क फील्ड गुण हैं और उज्जवल छवियां प्रदर्शित करता है। कंट्रास्ट छोटा है; उत्तरार्द्ध अंधेरे क्षेत्र के प्रकाश पथ के गुणों को बरकरार रखता है, इसलिए प्रदर्शित छवि अधिक गहरी होती है, और कंट्रास्ट में सुधार होता है। जब वास्तव में प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग किया जाता है, तो अवलोकन के लिए उस रोशनी विधि का उपयोग किया जाना चाहिए जो नमूने की आवश्यकताओं के लिए सबसे उपयुक्त हो।
यह बताया जाना चाहिए कि भले ही यूवी-उत्तेजित डार्क फील्ड कंडेनसर को सबसे अच्छे कंट्रास्ट के साथ रोशन किया जाता है, नमूने द्वारा अपवर्तित या बिखरे हुए पराबैंगनी उत्तेजना प्रकाश का हिस्सा उद्देश्य लेंस में प्रवेश करेगा। ऑटोफ्लोरेसेंस छवि प्रतिक्रिया को खराब कर सकता है। इसलिए, कट-ऑफ फिल्टर के रूप में ऐपिस के सामने एक यूवी-अवशोषित फिल्टर का उपयोग किया जाना चाहिए।
