कन्फोकल माइक्रोस्कोपी के सिद्धांत
कन्फोकल माइक्रोस्कोप एक उच्च परिशुद्धता इमेजिंग उपकरण है जो 1980 के दशक में उभरा और विकसित हुआ, और सबमाइक्रोन संरचनाओं का अध्ययन करने के लिए एक आवश्यक वैज्ञानिक अनुसंधान उपकरण है। कंप्यूटर, इमेज प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर और लेजर के विकास के साथ, कन्फोकल माइक्रोस्कोप का भी काफी विकास हुआ है, और अब जीवविज्ञान, माइक्रोसिस्टम्स और सामग्री माप के क्षेत्र में व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। कन्फोकल माइक्रोस्कोप एक नए प्रकार का माइक्रोस्कोप है जो कन्फोकल सिद्धांत, स्कैनिंग तकनीक और कंप्यूटर ग्राफिक्स प्रोसेसिंग तकनीक को एकीकृत करता है। इसके मुख्य लाभ हैं: उच्च पार्श्व रिज़ॉल्यूशन और उच्च अक्षीय रिज़ॉल्यूशन, और उच्च कंट्रास्ट के साथ आवारा प्रकाश का प्रभावी दमन।
एक विशिष्ट कन्फोकल माइक्रोस्कोप सेटअप में मापी गई वस्तु के फोकल तल के संयुग्मित तल पर दो छोटे छेद रखना होता है, जिनमें से एक को प्रकाश स्रोत के सामने रखा जाता है और दूसरे को डिटेक्टर के सामने रखा जाता है, जैसा कि चित्र में दिखाया गया है। 1. यह चित्र से देखा जा सकता है कि जब मापा गया नमूना अर्ध-फोकस विमान में होता है, तो पता लगाने के अंत द्वारा एकत्र की गई प्रकाश की तीव्रता सबसे बड़ी होती है; जब मापा गया नमूना फोकस से बाहर की स्थिति में होता है, तो पता लगाने वाले सिरे पर प्रकाश स्थान फैल जाता है और प्रकाश की तीव्रता तेजी से कम हो जाती है। इसलिए, केवल फोकल विमान पर बिंदुओं द्वारा उत्सर्जित प्रकाश ही निकास पिनहोल से गुजर सकता है, जबकि फोकल विमान के बाहर बिंदुओं द्वारा उत्सर्जित प्रकाश निकास पिनहोल विमान पर विकेंद्रित होता है, और उनमें से अधिकांश केंद्रीय पिनहोल से नहीं गुजर सकते हैं। इसलिए, फोकल प्लेन पर अवलोकन लक्ष्य बिंदु उज्ज्वल दिखाई देता है, और गैर-अवलोकन बिंदु पृष्ठभूमि के रूप में काला दिखाई देता है, जिससे कंट्रास्ट बढ़ता है और छवि साफ हो जाती है। इमेजिंग प्रक्रिया के दौरान, दो पिनहोल कन्फोकल होते हैं, कन्फोकल बिंदु पता लगाया गया बिंदु होता है, और वह तल जहां पता लगाया गया बिंदु स्थित होता है वह कन्फोकल विमान होता है।
कन्फोकल माइक्रोस्कोपी में डिटेक्टर पर पिनहोल का आकार एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। यह सीधे सिस्टम के रिज़ॉल्यूशन और सिग्नल-टू-शोर अनुपात को प्रभावित करता है। यदि पिनहोल बहुत बड़ा है, तो कन्फोकल डिटेक्शन प्रभाव प्राप्त नहीं किया जाएगा, जो न केवल सिस्टम के रिज़ॉल्यूशन को कम करता है, बल्कि अधिक आवारा प्रकाश भी पेश करता है; यदि पिनहोल बहुत छोटा है, तो यह पता लगाने की दक्षता को कम कर देगा और सूक्ष्म छवि को कम कर देगा। चमक. अध्ययनों से पता चला है कि जब पिनहोल का व्यास हवादार डिस्क के व्यास के बराबर होता है, तो कन्फोकल आवश्यकताएं पूरी हो जाती हैं, और पता लगाने की दक्षता में काफी कमी नहीं आती है। चूंकि पिनहोल का व्यास आम तौर पर माइक्रोन के क्रम पर होता है, यदि लेजर बीम के फोकस बिंदु और पिनहोल की स्थिति के बीच विचलन होता है, तो सिग्नल विरूपण होगा। इसलिए, कन्फोकल माइक्रोस्कोप आम तौर पर एक ऑटोफोकस प्रणाली का उपयोग करते हैं, जो वस्तुतः माप समय को बढ़ाता है।
चूंकि लेज़र कन्फोकल स्कैनिंग माइक्रोस्कोप एक बिंदु इमेजिंग है, इसलिए वस्तु की द्वि-आयामी छवि प्राप्त करने के लिए, x और y दिशाओं में द्वि-आयामी स्कैनिंग का उपयोग करना आवश्यक है। विभिन्न सूक्ष्मदर्शी विभिन्न स्कैनिंग विधियों का उपयोग करते हैं:
(1) वस्तु स्कैनिंग। अर्थात्, वस्तु स्वयं एक निश्चित नियम के अनुसार चलती है, जबकि प्रकाश किरण अपरिवर्तित रहती है। लाभ: स्थिर ऑप्टिकल पथ; नुकसान: एक बड़ी स्कैनिंग टेबल की आवश्यकता होती है, इसलिए स्कैनिंग की गति बहुत सीमित होती है।
(2) परावर्तक गैल्वेनोमीटर का उपयोग करके एक बीम स्कैनिंग प्रणाली बनाई जाती है। अर्थात्, स्कैनिंग गैल्वेनोमीटर को नियंत्रित करके, केंद्रित प्रकाश स्थान को द्वि-आयामी स्कैनिंग को पूरा करने के लिए वस्तु की एक निश्चित परत पर नियमित रूप से प्रतिबिंबित किया जाता है। इसका लाभ यह है कि इसमें उच्च परिशुद्धता होती है और इसका उपयोग अक्सर उच्च परिशुद्धता माप के लिए किया जाता है। ऑब्जेक्ट स्कैनिंग की तुलना में स्कैनिंग गति में सुधार हुआ है, लेकिन यह अभी भी तेज़ नहीं है।
(3) स्कैनिंग के लिए ध्वनि-ऑप्टिक विक्षेपण तत्व का उपयोग करें, और ध्वनि तरंग की आउटपुट आवृत्ति को बदलकर और फिर प्रकाश तरंग की संचरण दिशा को बदलकर स्कैनिंग का एहसास किया जाता है। इसका उत्कृष्ट लाभ यह है कि स्कैनिंग की गति बहुत तेज़ है। संयुक्त राज्य अमेरिका द्वारा विकसित स्कैनिंग प्रणाली वास्तविक समय की वीडियो छवियां उत्पन्न करने के लिए एक एकोस्टो-ऑप्टिक डिफ्लेक्टर का उपयोग करती है। एक द्वि-आयामी छवि को स्कैन करने में केवल 1/30 सेकंड का समय लगता है, और यह लगभग वास्तविक समय आउटपुट प्राप्त करता है।
(4) निपको डिस्क स्कैनिंग। अन्य घटकों को स्थिर रखते हुए निप्को डिस्क को घुमाकर स्कैनिंग प्रक्रिया पूरी की जाती है। इसकी छवि एक बार में ही ली जा सकती है और गति बहुत तेज़ है। हालाँकि, चूंकि इमेजिंग बीम ऑफ-एक्सिस लाइट है, इसलिए लेंस के ऑफ-एक्सिस विपथन को ठीक किया जाना चाहिए, और प्रकाश ऊर्जा की उपयोग दर बहुत कम है।
