मल्टीफोटोन माइक्रोस्कोपी इमेजिंग: विवो में न्यूरॉन्स की इमेजिंग के लिए विविध तकनीकें
पारंपरिक सिंगल-फोटॉन वाइड-फील्ड प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप की तुलना में, मल्टीफोटोन माइक्रोस्कोपी (एमपीएम) में ऑप्टिकल सेक्शनिंग और डीप इमेजिंग के कार्य होते हैं। 2019 में, जेरोम लेकोक एट अल। तीन पहलुओं से संबंधित एमपीएम तकनीक पर चर्चा की गई: मस्तिष्क में गहरी न्यूरॉन इमेजिंग, बड़े पैमाने पर न्यूरॉन इमेजिंग, और उच्च गति न्यूरॉन इमेजिंग।
न्यूरॉन गतिविधि को जटिल व्यवहार से जोड़ने के लिए, आमतौर पर गहरे कॉर्टेक्स में न्यूरॉन्स की छवि बनाना आवश्यक होता है, जिसके लिए एमपीएम में गहरी इमेजिंग की क्षमता की आवश्यकता होती है। उत्तेजना और उत्सर्जन प्रकाश जैविक ऊतक द्वारा अत्यधिक बिखरा हुआ और अवशोषित होगा, जो एमपीएम की इमेजिंग गहराई को सीमित करने वाला मुख्य कारक है। हालाँकि लेज़र की तीव्रता को बढ़ाकर बिखरने की समस्या को हल किया जा सकता है, लेकिन यह अन्य समस्याएं लाएगा, जैसे नमूना जलाना, डीफोकसिंग और निकट-सतह फ्लोरोसेंट उत्तेजना। एमपीएम इमेजिंग की गहराई बढ़ाने का सबसे अच्छा तरीका उत्तेजना प्रकाश के रूप में लंबी तरंग दैर्ध्य का उपयोग करना है।
इसके अलावा, दो-फोटॉन (2P) इमेजिंग के लिए, आउट-ऑफ-फोकस और निकट-सतह प्रतिदीप्ति उत्तेजना दो सबसे बड़े गहराई-सीमित कारक हैं, जबकि तीन-फोटॉन (3P) इमेजिंग के लिए, ये दो समस्याएं बहुत कम हो जाती हैं, लेकिन प्रतिदीप्ति के कारण तीन-फोटॉन इमेजिंग समूह का अवशोषण क्रॉस-सेक्शन 2P की तुलना में बहुत छोटा है, इसलिए 2P द्वारा उत्तेजित समान तीव्रता प्रतिदीप्ति संकेत प्राप्त करने के लिए उच्च पल्स ऊर्जा के परिमाण की आवश्यकता होती है। कार्यात्मक 3पी माइक्रोस्कोपी संरचनात्मक 3पी माइक्रोस्कोपी की तुलना में अधिक मांग वाली है, जिसे समय पर न्यूरोनल गतिविधि का नमूना लेने के लिए तेजी से स्कैनिंग की आवश्यकता होती है; प्रत्येक पिक्सेल के ठहराव समय के भीतर पर्याप्त सिग्नल एकत्र करने के लिए उच्च पल्स ऊर्जा की आवश्यकता होती है।
जटिल व्यवहारों में अक्सर स्थानीय और लंबी दूरी के कनेक्शन वाले बड़े मस्तिष्क नेटवर्क शामिल होते हैं। न्यूरॉन गतिविधि को व्यवहार से जोड़ने के लिए, एक ही समय में बहुत बड़े और व्यापक रूप से वितरित न्यूरॉन्स की गतिविधि की निगरानी करना आवश्यक है। मस्तिष्क में तंत्रिका नेटवर्क आने वाली उत्तेजनाओं को दसियों मिलीसेकंड के भीतर संसाधित करता है। इस तेज़ तंत्रिका नेटवर्क को समझने के लिए न्यूरॉन गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए, एमपीएम को तेजी से न्यूरॉन्स की छवि बनाने की क्षमता की आवश्यकता होती है। तेज़ एमपीएम विधियों को सिंगल-बीम स्कैनिंग तकनीक और मल्टी-बीम स्कैनिंग तकनीक में विभाजित किया जा सकता है।
सिंगल-बीम स्कैनिंग तकनीक बड़े दृश्य क्षेत्र (FOV) के साथ तंत्रिका ऊतक के उच्च गति ट्रैवर्सल को सक्षम बनाती है।
छवि न्यूरॉन्स के लिए एमपीएम का उपयोग करते समय, रैंडम-एक्सेस स्कैनिंग - यानी, लेजर बीम को दृश्य के पूरे क्षेत्र पर किसी भी चयनित बिंदु पर जल्दी से स्कैन किया जाता है - केवल रुचि के न्यूरॉन्स को स्कैन कर सकता है, जो न केवल किसी भी लेबल रहित तंत्रिका फाइबर को स्कैन करने से बचता है। लेजर बीम के स्कैनिंग समय को भी अनुकूलित करें। रैंडम-एक्सेस स्कैनिंग (छवि 1) एक एकोस्टो-ऑप्टिक डिफ्लेक्टर (एओडी) के साथ प्राप्त की जा सकती है, जो एक पीजोइलेक्ट्रिक ट्रांसड्यूसर को रेडियो-फ्रीक्वेंसी सिग्नल के साथ एक उपयुक्त क्रिस्टल से जोड़कर काम करता है। परिणामी ध्वनिक तरंगें एक आवधिक अपवर्तक सूचकांक झंझरी को प्रेरित करती हैं, विवर्तन तब होता है जब एक लेजर किरण झंझरी से गुजरती है। विवर्तित प्रकाश की तीव्रता और दिशा को बदलने के लिए ध्वनि तरंग की तीव्रता और आवृत्ति को रेडियो आवृत्ति विद्युत संकेत द्वारा समायोजित किया जा सकता है, ताकि एक एओडी का उपयोग करके एक आयामी क्षैतिज मनमानी बिंदु स्कैनिंग का एहसास किया जा सके, और 3 डी का एहसास किया जा सके अन्य अक्षीय स्कैनिंग प्रौद्योगिकियों के साथ संयुक्त एओडी की एक जोड़ी का उपयोग करके रैंडम एक्सेस स्कैनिंग। हालाँकि, यह तकनीक नमूने की गति के प्रति बहुत संवेदनशील है और कलाकृतियों की गति के प्रति संवेदनशील है। वर्तमान में, तेज़ रैस्टर स्कैनिंग, यानी FOV में प्रगतिशील स्कैनिंग, का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है क्योंकि एल्गोरिदम गति कलाकृतियों को आसानी से हल कर सकता है।
विवो में नियोकोर्टिकल एल2/3 न्यूरॉन्स की एओडी-आधारित दो-फोटॉन इमेजिंग[2]
तेज़ रेखापुंज स्कैनिंग को प्राप्त करने के कई तरीके हैं, तेज़ 2D स्कैनिंग के लिए एक कंपन दर्पण का उपयोग करना, तेज़ 3D स्कैनिंग के लिए एक कंपन दर्पण और एक समायोज्य इलेक्ट्रिक लेंस का संयोजन, लेकिन समायोज्य इलेक्ट्रिक लेंस सीमा के कारण अक्षीय दिशा में जल्दी से ध्यान केंद्रित नहीं कर सकता है यांत्रिक जड़ता स्विचिंग, जो इमेजिंग गति को प्रभावित करती है, को अब एक स्थानिक प्रकाश मॉड्यूलेटर (एसएलएम) से बदला जा सकता है।
रिमोट फोकसिंग भी 3डी इमेजिंग प्राप्त करने का एक साधन है, जैसा कि चित्र 2 में दिखाया गया है। एलएसयू मॉड्यूल में, स्कैनिंग गैल्वेनोमीटर क्षैतिज रूप से स्कैन करता है, और एएसयू मॉड्यूल में उद्देश्य लेंस एल 1 और दर्पण एम शामिल है, और अक्षीय स्कैनिंग को समायोजित करके महसूस किया जाता है एम की स्थिति। यह तकनीक न केवल मुख्य उद्देश्य लेंस एल2 द्वारा प्रस्तुत ऑप्टिकल विपथन को ठीक कर सकती है, बल्कि तेज अक्षीय स्कैनिंग को भी सक्षम कर सकती है। अधिक न्यूरॉन इमेजिंग प्राप्त करने के लिए, माइक्रोस्कोप के ऑब्जेक्टिव लेंस डिज़ाइन को समायोजित करके FOV को बढ़ाया जा सकता है, लेकिन बड़े NA और बड़े FOV वाले ऑब्जेक्टिव लेंस आमतौर पर भारी होते हैं और तेजी से अक्षीय स्कैनिंग के लिए जल्दी से नहीं चल सकते हैं, इसलिए बड़े FOV सिस्टम टेलीफोकस पर निर्भर होते हैं , एसएलएम और समायोज्य मोटर चालित लेंस।
रिमोट फोकसिंग दो-फोटॉन इमेजिंग सिस्टम का योजनाबद्ध आरेख [3] मल्टी-बीम स्कैनिंग तकनीक एक साथ न्यूरोनल ऊतक की विभिन्न स्थितियों की छवि बना सकती है
This technique3 typically uses two independent paths for imaging two distant (>1-2 मिमी अलग) इमेजिंग साइटें (चित्र 3सी,डी); निकटवर्ती क्षेत्रों के लिए, यह आमतौर पर इमेजिंग के लिए एकल उद्देश्य लेंस के एकाधिक बीम का उपयोग करता है (चित्र 3ई,एफ)। मल्टी-बीम स्कैनिंग तकनीक में उत्तेजना किरणों के बीच क्रॉसस्टॉक समस्या पर विशेष ध्यान देना चाहिए, जिसे पोस्ट-लाइट स्रोत पृथक्करण विधि या स्पेस-टाइम मल्टीप्लेक्सिंग विधि द्वारा हल किया जा सकता है। पोस्ट-हॉक प्रकाश स्रोत पृथक्करण विधि क्रॉसस्टॉक को खत्म करने के लिए बीम को अलग करने के लिए एल्गोरिदम के उपयोग को संदर्भित करती है; टाइम-स्पेस मल्टीप्लेक्सिंग विधि कई उत्तेजना किरणों के एक साथ उपयोग को संदर्भित करती है, प्रत्येक किरण की दालों को समय में विलंबित किया जाता है, ताकि विभिन्न किरणों द्वारा उत्तेजित व्यक्तिगत किरणों को अस्थायी रूप से अलग किया जा सके। फ्लोरोसेंट संकेत. अधिक बीमों को शामिल करके अधिक न्यूरॉन्स की छवि बनाई जा सकती है, लेकिन एकाधिक बीम प्रतिदीप्ति क्षय समय के ओवरलैप को बढ़ा देंगे, जो सिग्नल स्रोतों को अलग करने की क्षमता को सीमित करता है; और मल्टीप्लेक्सिंग से इलेक्ट्रॉनिक उपकरणों की कार्य गति पर नकारात्मक प्रभाव पड़ता है। उच्च आवश्यकताएं; बड़ी संख्या में बीमों को एकल बीम के अनुमानित सिग्नल-टू-शोर अनुपात को बनाए रखने के लिए उच्च लेजर शक्ति की भी आवश्यकता होती है, जिससे आसानी से ऊतक क्षति हो सकती है।
बड़े क्षेत्र की इमेजिंग प्रौद्योगिकी
हाल के वर्षों में, विभिन्न एमपीएम प्रौद्योगिकियों के विकास ने तंत्रिका ऊतक की हमारी इमेजिंग के दायरे को व्यापक बना दिया है, जिससे हमें तेज गति से मस्तिष्क में गहराई से अधिक न्यूरॉन्स की छवि बनाने की अनुमति मिली है, जिसने तंत्रिका विज्ञान अनुसंधान को बहुत बढ़ावा दिया है और हमें स्पष्ट समझ हासिल करने में सक्षम बनाया है। मस्तिष्क के कार्य का.
