लेजर कन्फोकल माइक्रोस्कोप की विशेषताएं और अनुप्रयोग
जबकि एक सामान्य सूक्ष्मदर्शी में प्रेक्षण के प्रतिबिम्ब तल को डिटेक्टर के साथ ऑब्जेक्टिव लेंस के फोकल तल को ओवरलैप करके पड़ोसी अक्षीय तलों से पृथक किया जाता है, एक कॉन्फोकल सूक्ष्मदर्शी में यह पृथक्करण एक विवर्तन-सीमित प्रकाश बिंदु के साथ नमूने को प्रकाशित करके और इस पृथक्करण को प्राप्त करने के लिए प्रकाश के इस बिंदु के संयुग्मी फोकस पर एकत्रित प्रकाश के मार्ग में एक पिनहोल का उपयोग करके भटके हुए प्रकाश को फ़िल्टर करके प्राप्त किया जाता है और इस प्रकार रिज़ोल्यूशन में सुधार किया जाता है।
केवल संयुग्मित नमूना परत से परावर्तित प्रकाश ही संग्रह प्रकाश पथ में पिनहोल से होकर गुजर सकता है, जबकि शेष अप्रासंगिक नमूना परत प्रतिबिंब पिनहोल द्वारा अवरुद्ध हो जाते हैं। इससे संकल्प में उल्लेखनीय वृद्धि होती है। नीचे एक ही मोटे नमूने की बहुआयामी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी की एक साथ तुलना दिखाई गई है। जब विभिन्न फोकल प्लेन पर छवियों की एक श्रृंखला ली जाती है, तो एक छवि जिसे आमतौर पर "z-स्टैक" के रूप में संदर्भित किया जाता है, जो कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा प्रदान किए गए संकल्प और कंट्रास्ट लाभ और इन लाभों के अंतर्निहित कारणों को दर्शाता है। यह देखा जा सकता है कि स्टैक के शीर्ष पर छवि की जांच करने पर जहां इमेजिंग प्लेन ऊतक के ऊपर होता है, प्रतिदीप्ति छवि में बिखरी हुई रोशनी की एक बड़ी मात्रा का पता चलता है, जबकि कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप छवि काली दिखाई देती है। अक्षीय दिशा में PSF में यह कमी सीधे z-स्टैक के बीच में ऑप्टिकल इंटरफ़ेस पर देखे गए संकल्प में अंतर में योगदान करती है।
ऑप्टिकल स्लाइस स्कैनिंग इमेजिंग
लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी की एक और विशेषता यह है कि यह एक स्कैनिंग इमेजिंग तकनीक है। पारंपरिक वाइड-फील्ड रोशनी तकनीक पूरे नमूने को रोशन करती है ताकि छवि को सीधे नग्न आंखों या डिटेक्टर द्वारा कैप्चर किया जा सके, लेकिन एलएससीएम नमूने के माध्यम से स्कैन करने के लिए प्रकाश की एक या अधिक केंद्रित किरणों का उपयोग करता है, ताकि परिणामी छवि को ऑप्टिकल स्लाइस कहा जाता है, जैसा कि निम्नलिखित आरेख में दिखाया गया है। पारंपरिक वाइड-फील्ड रोशनी और लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल रोशनी के बीच अंतर नीचे दिखाया गया है।
इसलिए, आधुनिक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का एक व्यावहारिक तरीका नीचे दिए गए चित्र में दिखाया गया है। लेजर से उत्तेजना प्रकाश को एक डाइक्रोइक दर्पण के माध्यम से पारित किया जाता है और नमूने की x-दिशा और y-दिशा में गैल्वेनोमीटर दर्पण की एक जोड़ी के माध्यम से स्कैन किया जाता है, और नमूने का उत्तेजना (या प्रतिबिंब) रिकॉर्ड किए जाने के लिए PMT डिटेक्टर में एक पिनहोल के माध्यम से गुजरता है, और रिकॉर्ड की गई स्कैन की गई छवि को नमूने की वास्तविक छवि बनाने के लिए कंप्यूटर द्वारा पुनर्निर्मित किया जाता है।
