कन्फोकल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी से संबंधित ज्ञान
कन्फोकल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का मूल सिद्धांत नमूना को विकिरणित करने के लिए एक बिंदु प्रकाश स्रोत का उपयोग करना है, जिससे फोकल विमान पर एक अच्छी तरह से परिभाषित छोटा स्थान बनता है। विकिरण के बाद स्पॉट द्वारा उत्सर्जित प्रतिदीप्ति को उद्देश्य लेंस द्वारा एकत्र किया जाता है और मूल विकिरण पथ के साथ एक द्विदिश रंग दर्पण से बने स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में वापस भेज दिया जाता है। स्पेक्ट्रोफोटोमीटर प्रतिदीप्ति को सीधे डिटेक्टर को भेजता है। प्रकाश स्रोत और डिटेक्टर के सामने दो पिनहोल होते हैं, जिन्हें क्रमशः रोशनी पिनहोल और डिटेक्शन पिनहोल कहा जाता है। दोनों के ज्यामितीय आयाम सुसंगत हैं, लगभग 100-200nm; फोकल विमान पर प्रकाश बिंदु की तुलना में, दोनों संयुग्मित हैं, जिसका अर्थ है कि प्रकाश बिंदु लेंस की एक श्रृंखला से गुजरता है और अंततः रोशनी पिनहोल और डिटेक्शन पिनहोल दोनों पर एक साथ ध्यान केंद्रित कर सकता है। इस तरह, फोकल प्लेन से प्रकाश डिटेक्शन होल की सीमा के भीतर परिवर्तित हो सकता है, जबकि फोकल प्लेन के ऊपर या नीचे से बिखरी हुई रोशनी डिटेक्शन होल के बाहर अवरुद्ध हो जाती है और उसकी छवि नहीं बनाई जा सकती है। लेज़र से नमूना को बिंदु दर बिंदु स्कैन करके, फोटोमल्टीप्लायर ट्यूब पिनहोल का पता लगाने के बाद बिंदु दर बिंदु प्रकाश बिंदु की संबंधित कन्फोकल छवि भी प्राप्त करती है, जिसे डिजिटल सिग्नल में परिवर्तित किया जाता है और कंप्यूटर पर प्रेषित किया जाता है। अंत में, पूरे फोकल विमान की एक स्पष्ट कन्फोकल छवि स्क्रीन पर संश्लेषित की जाती है।
प्रत्येक फोकल समतल छवि वास्तव में नमूने का एक ऑप्टिकल क्रॉस-सेक्शन है, जिसकी हमेशा एक निश्चित मोटाई होती है, जिसे ऑप्टिकल थिन सेक्शन के रूप में भी जाना जाता है। इस तथ्य के कारण कि फोकल बिंदु पर प्रकाश की तीव्रता गैर-फोकल बिंदु की तुलना में बहुत अधिक है, और गैर-फोकल समतल प्रकाश को पिनहोल द्वारा फ़िल्टर किया जाता है, कन्फोकल प्रणाली के क्षेत्र की गहराई लगभग शून्य है। जेड-अक्ष दिशा के साथ स्कैन करने से ऑप्टिकल टोमोग्राफी प्राप्त की जा सकती है, जो देखे गए नमूने के फोकल स्थान पर एक दो-आयामी ऑप्टिकल स्लाइस बनाती है। XY प्लेन (फोकल प्लेन) स्कैनिंग को Z-अक्ष (ऑप्टिकल एक्सिस) स्कैनिंग के साथ जोड़कर, दो-आयामी छवियों की निरंतर परतों को जमा करके और उन्हें विशेष कंप्यूटर सॉफ्टवेयर के साथ संसाधित करके नमूने की एक त्रि-आयामी छवि प्राप्त की जा सकती है।
डिटेक्शन पिनहोल और प्रकाश स्रोत पिनहोल हमेशा एक ही बिंदु पर केंद्रित होते हैं, ताकि फोकसिंग प्लेन के बाहर उत्तेजित प्रतिदीप्ति डिटेक्शन पिनहोल में प्रवेश न कर सके।
लेजर कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के कार्य सिद्धांत की सरल अभिव्यक्ति यह है कि यह प्रकाश स्रोत के रूप में एक लेजर का उपयोग करता है, और पारंपरिक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के आधार पर एक लेजर स्कैनिंग डिवाइस और एक संयुग्म फोकसिंग डिवाइस जोड़ता है। यह डिजिटल छवि अधिग्रहण और प्रसंस्करण के लिए कंप्यूटर द्वारा नियंत्रित एक प्रणाली है।
