प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का परिचय
प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी में फ्लोरेसिन से सना हुआ वस्तु को लघु-तरंग दैर्ध्य प्रकाश के साथ विकिरणित करना है, ताकि यह लंबी-तरंग दैर्ध्य प्रतिदीप्ति उत्पन्न करने के लिए उत्साहित हो, और फिर अवलोकन किया जा सके। प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप में, प्रतिदीप्ति उत्पन्न करने के लिए नमूने की रोशनी प्रकाश से एक विशिष्ट तरंग दैर्ध्य के उत्तेजना प्रकाश का चयन किया जाना चाहिए, और फिर अवलोकन के लिए प्रतिदीप्ति को उत्तेजना प्रकाश और प्रतिदीप्ति के मिश्रित प्रकाश से अलग किया जाना चाहिए। इसलिए, फ़िल्टर सिस्टम एक विशिष्ट तरंग दैर्ध्य का चयन करने में अत्यंत महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। जीव विज्ञान, चिकित्सा और अन्य क्षेत्रों में प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है।
1. प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी के मुख्य घटक:
(ए) प्रकाश स्रोत: प्रकाश स्रोत विभिन्न तरंग दैर्ध्य (पराबैंगनी से अवरक्त तक) का प्रकाश उत्सर्जित करता है।
(बी) उत्तेजना फ़िल्टर प्रकाश स्रोत: एक विशिष्ट तरंग दैर्ध्य के प्रकाश के माध्यम से जो नमूना को प्रतिदीप्ति उत्पन्न करने का कारण बन सकता है, जबकि प्रकाश को अवरुद्ध करता है जो रोमांचक प्रतिदीप्ति के लिए बेकार है।
(सी) फ्लोरोसेंट नमूने: आम तौर पर फ्लोरोसेंट पिगमेंट से रंगे होते हैं।
(डी) अवरुद्ध फिल्टर: उत्तेजना प्रकाश को अवरुद्ध करें जो नमूने द्वारा अवशोषित नहीं होता है और चुनिंदा रूप से प्रतिदीप्ति संचारित करता है, और कुछ तरंग दैर्ध्य प्रतिदीप्ति में चुनिंदा रूप से प्रसारित होते हैं।
2. प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी का वर्गीकरण:
प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी आम तौर पर दो प्रकारों में विभाजित होते हैं: संचरण और एपी-उत्सर्जन:
एक। ट्रांसमिशन प्रकार: उत्तेजना प्रकाश निरीक्षण की जाने वाली वस्तु के नीचे से आता है, और कंडेनसर एक डार्क फील्ड कंडेनसर है, ताकि उत्तेजना प्रकाश उद्देश्य लेंस में प्रवेश न करे, लेकिन प्रतिदीप्ति उद्देश्य लेंस में प्रवेश करती है। यह कम आवर्धन पर चमकीला होता है, लेकिन उच्च आवर्धन पर अंधेरा होता है। तेल विसर्जन और केन्द्रीकरण में काम करना कठिन है। कम आवर्धन पर प्रकाश सीमा निर्धारित करना विशेष रूप से कठिन है, लेकिन इससे दृश्य पृष्ठभूमि का बहुत गहरा क्षेत्र प्राप्त हो सकता है। ट्रांसमिशन प्रकार का उपयोग गैर-पारदर्शी वस्तुओं के लिए नहीं किया जाता है।
बी। एपि-प्रकार: वर्तमान में ट्रांसमिशन प्रकार लगभग समाप्त हो गया है। अधिकांश नए प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी एपि-प्रकार के हैं। प्रकाश स्रोत निरीक्षण की जाने वाली वस्तु के ऊपर से आता है, और ऑप्टिकल पथ में एक बीम स्प्लिटर होता है, इसलिए यह निरीक्षण के लिए पारदर्शी और अपारदर्शी दोनों वस्तुओं के लिए उपयुक्त है। चूंकि ऑब्जेक्टिव लेंस एक कंडेनसर लेंस के रूप में कार्य करता है, इसलिए इसे संचालित करना न केवल आसान है, बल्कि कम आवर्धन से उच्च आवर्धन तक पूरे दृश्य क्षेत्र की एक समान रोशनी भी प्राप्त कर सकता है।
3. फ्लोरोस्कोपी के लिए सावधानियां
एक। उत्तेजना प्रकाश के लंबे समय तक विकिरण से प्रतिदीप्ति क्षीणन और शमन होगा, इसलिए जितना संभव हो सके अवलोकन समय को कम करें, और अस्थायी रूप से अवलोकन न करने पर उत्तेजना प्रकाश को कवर करने के लिए एक बाफ़ल का उपयोग करें।
बी। तेल विसर्जन लेंस से अवलोकन करते समय, "गैर-फ्लोरोसेंट तेल" का उपयोग करें।
सी। प्रतिदीप्ति लगभग हमेशा कमजोर होती है और इसे अंधेरे कमरे में किया जाना चाहिए।
डी। बिजली आपूर्ति में वोल्टेज स्टेबलाइज़र स्थापित करना सबसे अच्छा है, अन्यथा अस्थिर वोल्टेज न केवल पारा लैंप के जीवन को कम करेगा, बल्कि माइक्रोस्कोप निरीक्षण के प्रभाव को भी प्रभावित करेगा।
4. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग
1. प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी नमूनों के लिए तैयारी आवश्यकताएँ
एक। कांच की स्लाइड
ग्लास स्लाइड की मोटाई 0.8 और 1.2 मिमी के बीच होनी चाहिए। एक स्लाइड जो बहुत मोटी है वह एक ओर अधिक प्रकाश को अवशोषित करेगी, और दूसरी ओर, उत्तेजना प्रकाश को नमूने पर केंद्रित नहीं किया जा सकता है। स्लाइड चिकनी, मोटाई में एक समान और स्पष्ट ऑटोफ्लोरेसेंस से मुक्त होनी चाहिए। कभी-कभी क्वार्ट्ज ग्लास स्लाइड का उपयोग किया जाता है।
बी। शीशे को ढको
कवर ग्लास की मोटाई लगभग 0.17 मिमी, चिकनी है। उत्तेजना प्रकाश को मजबूत करने के लिए, एक ड्राई कवर ग्लास का भी उपयोग किया जा सकता है, जो पदार्थों की कई परतों (जैसे मैग्नीशियम फ्लोराइड) के साथ लेपित एक विशेष कवर ग्लास होता है, जिसका विभिन्न तरंग दैर्ध्य के प्रकाश पर अलग-अलग हस्तक्षेप प्रभाव होता है, जो बना सकता है प्रतिदीप्ति सुचारू रूप से चलती है। उत्तेजना प्रकाश को पारित किया जाता है, और परावर्तित उत्तेजना प्रकाश नमूने को उत्तेजित करता है।
सी। नमूना
ऊतक के टुकड़े या अन्य नमूने बहुत मोटे नहीं होने चाहिए। यदि यह बहुत गाढ़ा है, तो अधिकांश उत्तेजना प्रकाश नमूने के निचले हिस्से में खपत हो जाएगा, जबकि वस्तुनिष्ठ लेंस द्वारा सीधे देखे गए ऊपरी हिस्से को पूरी तरह से उत्तेजित नहीं किया जा सकता है। इसके अलावा, सेल ओवरलैप या अशुद्धियाँ छिप जाती हैं, जिससे निर्णय प्रभावित होता है।
डी। माउंटिंग एजेंट
ग्लिसरीन का उपयोग आमतौर पर माउंटिंग एजेंट के रूप में किया जाता है, जिसमें कोई ऑटोफ्लोरेसेंस नहीं होना चाहिए, रंगहीन और पारदर्शी होना चाहिए, और पीएच 8 पर फ्लोरोसेंस की चमक तेज होती है। इसलिए, ग्लिसरॉल और 0.5mol/L कार्बोनेट बफर सॉल्यूशन का पीएच 9.{6}} से 9.5 के बराबर मिश्रण आमतौर पर माउंटिंग एजेंट के रूप में उपयोग किया जाता है।
इ। दर्पण तेल
आम तौर पर, अंधेरे-क्षेत्र प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी और तेल विसर्जन विसर्जन उद्देश्यों के साथ नमूनों का निरीक्षण करते समय विसर्जन तेल का उपयोग किया जाना चाहिए। विशेष गैर-फ्लोरोसेंट दर्पण तेल का उपयोग करना सबसे अच्छा है, जिसे उपर्युक्त ग्लिसरीन द्वारा भी प्रतिस्थापित किया जा सकता है, और तरल पैराफिन का भी उपयोग किया जा सकता है, लेकिन अपवर्तक सूचकांक कम है, जो छवि गुणवत्ता को थोड़ा प्रभावित करता है।
