प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी पारंपरिक माइक्रोस्कोपी से किस प्रकार भिन्न है
मैंने हाल ही में चूहों के कुछ जमे हुए हिस्से बनाने की कोशिश की है, और अब मुझे यह देखने के लिए एक फ्लोरोसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करने की ज़रूरत है कि जो वायरस मैंने इंजेक्ट किया है वह वांछित मस्तिष्क क्षेत्र में है या नहीं। प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के कुछ बुनियादी सिद्धांतों का संक्षेप में अध्ययन करने की आवश्यकता है, और मैं उन्हें यहां भी साझा करूंगा।
प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप परीक्षण की जा रही वस्तु को रोशन करने के लिए प्रकाश स्रोत के रूप में पराबैंगनी प्रकाश का उपयोग करता है, जिससे वस्तु प्रकाश स्रोत उत्सर्जित करती है, और फिर माइक्रोस्कोप के नीचे वस्तु का निरीक्षण करती है। मुख्य रूप से इम्यूनोफ्लोरेसेंस कोशिकाओं के लिए उपयोग किया जाता है, यह एक प्रकाश स्रोत, फिल्टर प्लेट सिस्टम और ऐपिस और ऑब्जेक्टिव लेंस के आवर्धन के माध्यम से नमूने की प्रतिदीप्ति छवि का निरीक्षण करने के लिए ऑप्टिकल सिस्टम से बना है। आइए इस प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप और एक नियमित ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के बीच अंतर पर एक नज़र डालें।
1. प्रकाश व्यवस्था के तरीकों के संदर्भ में
प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप की प्रकाश विधि आम तौर पर एक गिरती किरण विधि का उपयोग करती है, जिसका अर्थ है कि प्रकाश स्रोत को उद्देश्य लेंस के माध्यम से परीक्षण नमूने पर प्रक्षेपित किया जाता है।
2. संकल्प की दृष्टि से
प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी प्रकाश स्रोत के रूप में पराबैंगनी प्रकाश का उपयोग करती है, जिसमें अपेक्षाकृत कम तरंग दैर्ध्य लेकिन सामान्य ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप की तुलना में उच्च रिज़ॉल्यूशन होता है।
3. फ़िल्टर पर अंतर
एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप दो विशेष फिल्टर का उपयोग करता है, एक दृश्य प्रकाश को फ़िल्टर करने के लिए प्रकाश स्रोत के सामने, और दूसरा पराबैंगनी प्रकाश को फ़िल्टर करने के लिए उद्देश्य और ऐपिस के बीच, जो आंखों की रक्षा कर सकता है।
प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी भी एक प्रकार का ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप है, मुख्यतः क्योंकि प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा उत्तेजित तरंग दैर्ध्य छोटा होता है, जिससे प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और साधारण माइक्रोस्कोपी की संरचना और उपयोग में अंतर होता है। अधिकांश प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी कमजोर प्रकाश को पकड़ने का अच्छा कार्य करते हैं, इसलिए उनकी इमेजिंग क्षमता बेहद कमजोर प्रतिदीप्ति के तहत भी अच्छी होती है। इसके अलावा, हाल के वर्षों में प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के निरंतर सुधार के साथ, शोर में भी काफी कमी आई है। इसलिए, अधिक से अधिक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी का प्रयोग किया जा रहा है।
दो-फोटॉन प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी से संबंधित ज्ञान
दो-फोटॉन उत्तेजना का मूल सिद्धांत यह है कि उच्च फोटॉन घनत्व पर, फ्लोरोसेंट अणु एक साथ दो लंबी तरंग दैर्ध्य फोटॉन को अवशोषित कर सकते हैं, और तथाकथित उत्तेजित राज्य जीवनकाल की एक छोटी अवधि के बाद, एक छोटी तरंग दैर्ध्य फोटॉन उत्सर्जित कर सकते हैं; इसका प्रभाव फ्लोरोसेंट अणुओं को उत्तेजित करने के लिए लंबी तरंग दैर्ध्य के आधे तरंग दैर्ध्य वाले फोटॉन का उपयोग करने जैसा ही है। दो फोटॉन उत्तेजना के लिए उच्च फोटॉन घनत्व की आवश्यकता होती है, और कोशिकाओं को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए, दो-फोटॉन माइक्रोस्कोप में एक उच्च-ऊर्जा मोड-लॉक पल्स लेजर का उपयोग किया जाता है। इस प्रकार के लेजर द्वारा उत्सर्जित लेजर में उच्च शिखर ऊर्जा और कम औसत ऊर्जा होती है, जिसकी पल्स चौड़ाई केवल 100 फेमटोसेकंड और आवृत्ति 80 से 100 मेगाहर्ट्ज़ तक होती है। स्पंदित लेजर के फोटॉनों पर ध्यान केंद्रित करने के लिए उच्च संख्यात्मक एपर्चर उद्देश्य का उपयोग करते समय, उद्देश्य के केंद्र बिंदु पर फोटॉन घनत्व सबसे अधिक होता है, और दो-फोटॉन उत्तेजना केवल उद्देश्य के केंद्र बिंदु पर होती है। इसलिए, दो-फोटॉन माइक्रोस्कोप को कन्फोकल पिनहोल की आवश्यकता नहीं होती है, जो प्रतिदीप्ति पहचान की दक्षता में सुधार करती है।
सामान्य प्रतिदीप्ति घटना में, उत्तेजना के कम फोटॉन घनत्व के कारण, एक फ्लोरोसेंट अणु एक ही समय में केवल एक फोटॉन को अवशोषित कर सकता है, और फिर विकिरण संक्रमण के माध्यम से एक फ्लोरोसेंट फोटॉन उत्सर्जित कर सकता है, जिसे एकल फोटॉन प्रतिदीप्ति कहा जाता है। प्रकाश स्रोत के रूप में लेजर का उपयोग करके प्रतिदीप्ति उत्तेजना प्रक्रिया के लिए, दो-फोटॉन या यहां तक कि मल्टीफोटोन प्रतिदीप्ति घटनाएँ हो सकती हैं। इस समय, उपयोग किया जाने वाला उत्तेजना प्रकाश स्रोत उच्च तीव्रता का है, और फोटॉन घनत्व एक साथ दो फोटॉन को अवशोषित करने के लिए फ्लोरोसेंट अणुओं की आवश्यकता को पूरा करता है। उत्तेजना प्रकाश स्रोत के रूप में एक विशिष्ट लेजर का उपयोग करने की प्रक्रिया में, फोटॉन घनत्व अभी भी दो-फोटॉन अवशोषण घटना उत्पन्न करने के लिए पर्याप्त नहीं है। आमतौर पर, फेमटोसेकंड पल्स लेजर का उपयोग किया जाता है, और उनकी तात्कालिक शक्ति मेगावाट के स्तर तक पहुंच सकती है। इसलिए, दो-फोटॉन प्रतिदीप्ति की तरंग दैर्ध्य उत्तेजना की तुलना में कम है, जो आधे उत्तेजना तरंग दैर्ध्य उत्तेजना द्वारा उत्पन्न प्रभाव के बराबर है।
