प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी पारंपरिक माइक्रोस्कोपी से भिन्न होती है

प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी पारंपरिक माइक्रोस्कोपी से भिन्न होती है

प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी निरीक्षण की जाने वाली वस्तु को विकिरणित करने के लिए प्रकाश स्रोत के रूप में पराबैंगनी प्रकाश का उपयोग करते हैं, ताकि वस्तु प्रकाश उत्सर्जित करे, और फिर माइक्रोस्कोप के नीचे वस्तु का निरीक्षण करें। इसका उपयोग मुख्य रूप से इम्यूनोफ्लोरेसेंस कोशिकाओं के लिए किया जाता है। यह मुख्य रूप से एक प्रकाश स्रोत, एक फिल्टर प्लेट सिस्टम और ऐपिस और ऑब्जेक्टिव लेंस के आवर्धन के माध्यम से नमूने की फ्लोरोसेंट छवि का निरीक्षण करने के लिए एक ऑप्टिकल सिस्टम से बना है। आइए इस प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप और एक साधारण ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के बीच अंतर पर एक नज़र डालें।

1. प्रकाश व्यवस्था की विधि को देखो
प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी की रोशनी विधि आम तौर पर एपिस्कोपिक होती है, यानी प्रकाश स्रोत को वस्तुनिष्ठ लेंस के माध्यम से परीक्षण नमूने पर प्रक्षेपित किया जाता है।

2. संकल्प को देखो
प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी प्रकाश स्रोत के रूप में पराबैंगनी प्रकाश का उपयोग करते हैं, और तरंग दैर्ध्य अपेक्षाकृत कम होता है, लेकिन रिज़ॉल्यूशन सामान्य ऑप्टिकल सूक्ष्मदर्शी की तुलना में अधिक होता है।

3. फिल्टर में अंतर
प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी दो विशेष फिल्टर का उपयोग करते हैं, जिनका उपयोग दृश्य प्रकाश को फ़िल्टर करने के लिए प्रकाश स्रोत के सामने किया जाता है, और पराबैंगनी किरणों को फ़िल्टर करने के लिए उद्देश्य लेंस और ऐपिस के बीच उपयोग किया जाता है, जो मानव आंखों की रक्षा कर सकता है।

प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी भी एक प्रकार का ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप है, मुख्यतः क्योंकि प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी द्वारा उत्तेजित तरंग दैर्ध्य छोटा होता है, इसलिए इससे प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी और साधारण सूक्ष्मदर्शी के बीच संरचना और उपयोग में अंतर होता है। अधिकांश प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी कमजोर प्रकाश को पकड़ने का अच्छा कार्य करते हैं, इसलिए अत्यंत कमजोर प्रतिदीप्ति के तहत, इसकी इमेजिंग क्षमता भी अच्छी होती है। हाल के वर्षों में प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी के निरंतर सुधार के साथ, शोर भी काफी कम हो गया है। इसलिए अधिक से अधिक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी का उपयोग किया जाता है।

जोड़ा

फोटॉन प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के बारे में ज्ञान
दो-फोटॉन उत्तेजना का मूल सिद्धांत है: उच्च फोटॉन घनत्व के मामले में, फ्लोरोसेंट अणु एक ही समय में दो लंबी-तरंग दैर्ध्य फोटॉन को अवशोषित कर सकते हैं, और एक छोटी तथाकथित उत्तेजित अवस्था के जीवनकाल के बाद एक छोटी-तरंग दैर्ध्य फोटॉन का उत्सर्जन कर सकते हैं; इसका प्रभाव फ्लोरोसेंट अणुओं को उत्तेजित करने के लिए लंबी तरंग दैर्ध्य के आधे तरंग दैर्ध्य वाले फोटॉन का उपयोग करने जैसा ही है। दो-फोटॉन उत्तेजना के लिए उच्च फोटॉन घनत्व की आवश्यकता होती है। कोशिकाओं को नुकसान न पहुँचाने के लिए, दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी उच्च-ऊर्जा मोड-लॉक स्पंदित लेजर का उपयोग करती है। इस लेजर द्वारा उत्सर्जित लेजर में उच्च शिखर ऊर्जा और कम औसत ऊर्जा होती है, इसकी पल्स चौड़ाई केवल 100 फेमटोसेकंड होती है, और इसकी आवृत्ति 80 से 100 मेगाहर्ट्ज़ तक पहुंच सकती है। स्पंदित लेजर के फोटॉन पर ध्यान केंद्रित करने के लिए उच्च संख्यात्मक एपर्चर ऑब्जेक्टिव लेंस का उपयोग करते समय, ऑब्जेक्टिव लेंस के फोकल बिंदु पर फोटॉन घनत्व सबसे अधिक होता है, और दो-फोटॉन उत्तेजना केवल ऑब्जेक्टिव लेंस के फोकल बिंदु पर होती है, इसलिए दो-फोटॉन माइक्रोस्कोप को कन्फोकल पिनहोल की आवश्यकता नहीं होती है, जो प्रतिदीप्ति पहचान दक्षता में सुधार करती है।

सामान्य प्रतिदीप्ति घटना में, उत्तेजना प्रकाश के कम फोटॉन घनत्व के कारण, एक फ्लोरोसेंट अणु एक ही समय में केवल एक फोटॉन को अवशोषित कर सकता है, और फिर एक विकिरण संक्रमण के माध्यम से एक फ्लोरोसेंट फोटॉन उत्सर्जित कर सकता है, जो एकल-फोटॉन प्रतिदीप्ति है। प्रकाश स्रोत के रूप में लेजर का उपयोग करके प्रतिदीप्ति उत्तेजना प्रक्रिया के लिए, दो-फोटॉन या यहां तक ​​कि बहु-फोटॉन प्रतिदीप्ति हो सकती है। इस समय, उपयोग किए जाने वाले उत्तेजना प्रकाश स्रोत की तीव्रता अधिक होती है, और फोटॉन घनत्व एक ही समय में दो फोटॉन को अवशोषित करने वाले फ्लोरोसेंट अणुओं की आवश्यकताओं को पूरा करता है। उत्तेजना प्रकाश स्रोत के रूप में एक सामान्य लेजर का उपयोग करने की प्रक्रिया में, फोटॉन घनत्व अभी भी दो-फोटॉन अवशोषण घटना उत्पन्न करने के लिए पर्याप्त नहीं है। आमतौर पर, एक फेमटोसेकंड स्पंदित लेजर का उपयोग किया जाता है, और इसकी तात्कालिक शक्ति मेगावाट के क्रम तक पहुंच सकती है। इसलिए, दो-फोटॉन प्रतिदीप्ति की तरंग दैर्ध्य उत्तेजना प्रकाश की तरंग दैर्ध्य से कम है, जो उत्तेजना तरंग दैर्ध्य के आधे पर उत्तेजना द्वारा उत्पन्न प्रभाव के बराबर है।

दो-फोटॉन प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के कई फायदे हैं:

1) लंबी-तरंगदैर्ध्य प्रकाश लघु-तरंगदैर्ध्य प्रकाश की तुलना में प्रकीर्णन से कम प्रभावित होता है और आसानी से नमूने में प्रवेश कर जाता है;

2) फोकल तल के बाहर फ्लोरोसेंट अणु उत्तेजित नहीं होते हैं, ताकि अधिक उत्तेजना प्रकाश फोकल तल तक पहुंच सके, ताकि उत्तेजना प्रकाश गहरे नमूनों में प्रवेश कर सके;

3) दीर्घ-तरंगदैर्घ्य निकट-अवरक्त प्रकाश, लघु-तरंगदैर्घ्य प्रकाश की तुलना में कोशिकाओं के लिए कम विषैला होता है;

4) नमूनों का निरीक्षण करने के लिए दो-फोटॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग करते समय, फोटोब्लीचिंग और फोटोटॉक्सिसिटी केवल फोकल प्लेन में होती है। इसलिए, मोटे नमूनों के अवलोकन के लिए, जीवित कोशिकाओं के अवलोकन के लिए, या स्पॉट फोटोब्लीचिंग प्रयोगों के लिए एकल-फोटॉन माइक्रोस्कोपी की तुलना में दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी अधिक उपयुक्त है।

कन्फोकल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के बारे में ज्ञान

कन्फोकल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का मूल सिद्धांत: नमूना एक बिंदु प्रकाश स्रोत द्वारा विकिरणित होता है, और फोकल विमान पर एक छोटा, अच्छी तरह से परिभाषित प्रकाश स्थान बनता है। बिंदु के विकिरणित होने के बाद, उत्सर्जित प्रतिदीप्ति को वस्तुनिष्ठ लेंस द्वारा एकत्र किया जाता है और मूल रोशनी पथ के साथ एक डाइक्रोइक दर्पण से बने बीम स्प्लिटर में वापस भेज दिया जाता है। बीम स्प्लिटर प्रतिदीप्ति को सीधे डिटेक्टर को भेजता है। प्रकाश स्रोत और डिटेक्टर के सामने एक पिनहोल होता है, जिसे क्रमशः रोशनी पिनहोल और डिटेक्शन पिनहोल कहा जाता है। दोनों का ज्यामितीय आकार समान है, लगभग 100-200nm; फोकल तल पर प्रकाश स्थान के सापेक्ष, दोनों संयुग्मित होते हैं, अर्थात, प्रकाश स्थान लेंस की एक श्रृंखला से होकर गुजरता है, और अंत में एक ही समय में रोशनी पिनहोल और डिटेक्शन पिनहोल पर ध्यान केंद्रित किया जा सकता है। इस तरह, फोकल प्लेन से प्रकाश को डिटेक्शन होल के दायरे में परिवर्तित किया जा सकता है, जबकि फोकल प्लेन के ऊपर या नीचे से बिखरी हुई रोशनी डिटेक्शन होल के बाहर अवरुद्ध होती है और इसकी छवि नहीं बनाई जा सकती है। लेज़र नमूना को बिंदु दर बिंदु स्कैन करता है, और फोटोमल्टीप्लायर ट्यूब पिनहोल का पता लगाने के बाद बिंदु दर बिंदु संबंधित प्रकाश बिंदु की कन्फोकल छवि भी प्राप्त करता है, जिसे एक डिजिटल सिग्नल में परिवर्तित किया जाता है और कंप्यूटर में प्रेषित किया जाता है, और अंत में एक स्पष्ट रूप में एकत्रित किया जाता है। स्क्रीन पर संपूर्ण फ़ोकल तल की कन्फ़ोकल छवि।

प्रत्येक फोकल समतल छवि वास्तव में नमूने का एक ऑप्टिकल क्रॉस-सेक्शन है, और इस ऑप्टिकल क्रॉस-सेक्शन में हमेशा एक निश्चित मोटाई होती है, जिसे ऑप्टिकल थिन सेक्शन के रूप में भी जाना जाता है। चूंकि फोकल बिंदु पर प्रकाश की तीव्रता गैर-फोकस बिंदु की तुलना में बहुत अधिक है, और गैर-फोकल समतल प्रकाश को पिनहोल द्वारा फ़िल्टर किया जाता है, कन्फोकल प्रणाली के क्षेत्र की गहराई लगभग शून्य है, और स्कैनिंग के साथ जेड-अक्ष ऑप्टिकल टोमोग्राफी का एहसास कर सकता है, जो देखे जाने वाले नमूने के केंद्रित स्थान पर एक दो-आयामी ऑप्टिकल स्लाइस बनाता है। XY प्लेन (फोकल प्लेन) स्कैनिंग को Z-अक्ष (ऑप्टिकल एक्सिस) स्कैनिंग के साथ जोड़कर, निरंतर परतों की दो-आयामी छवियों को जमा करके और विशेष कंप्यूटर सॉफ्टवेयर द्वारा संसाधित करके नमूने की त्रि-आयामी छवि प्राप्त की जा सकती है।

यानी, डिटेक्शन पिनहोल और प्रकाश स्रोत पिनहोल हमेशा एक ही बिंदु पर केंद्रित होते हैं, ताकि फोकल प्लेन के बाहर उत्तेजित प्रतिदीप्ति डिटेक्शन पिनहोल में प्रवेश न कर सके।

लेजर कन्फोकल के कार्य सिद्धांत की सरल अभिव्यक्ति यह है कि यह प्रकाश स्रोत के रूप में लेजर प्रकाश का उपयोग करता है। पारंपरिक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप इमेजिंग के आधार पर, यह एक लेजर स्कैनिंग डिवाइस और एक संयुग्म फोकसिंग डिवाइस जोड़ता है, और यह कंप्यूटर नियंत्रण के माध्यम से डिजिटल छवि अधिग्रहण और प्रसंस्करण के लिए एक प्रणाली है।