प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी और साधारण प्रकाशीय सूक्ष्मदर्शी में अंतर और विशेषताएं
प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी और साधारण प्रकाशीय सूक्ष्मदर्शी भिन्न होते हैं, यह नमूने का निरीक्षण करने के लिए साधारण प्रकाश स्रोत की रोशनी के माध्यम से नहीं होता है, बल्कि माइक्रोस्कोप के नीचे नमूने के भीतर प्रतिदीप्ति पदार्थ के प्रकाश की एक निश्चित तरंगदैर्ध्य (आमतौर पर पराबैंगनी, नीली-बैंगनी रोशनी) उत्तेजना का उपयोग करता है, ताकि प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी प्रकाश स्रोत की प्रतिदीप्ति प्रत्यक्ष रोशनी की भूमिका न निभाए, बल्कि ऊर्जा स्रोत के नमूने के भीतर प्रतिदीप्ति पदार्थ की उत्तेजना के रूप में हो। हम नमूने का निरीक्षण क्यों कर सकते हैं इसका कारण प्रकाश स्रोत की रोशनी नहीं है, बल्कि उत्तेजना की प्रकाश ऊर्जा को अवशोषित करने के बाद नमूने में प्रतिदीप्ति पदार्थ द्वारा प्रस्तुत प्रतिदीप्ति घटना है। यह देखा जा सकता है कि प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी की विशेषताएँ, मुख्य रूप से इसका प्रकाश स्रोत उत्तेजना प्रकाश की विशिष्ट तरंगदैर्ध्य सीमा की एक बड़ी संख्या की आपूर्ति कर सकता है, ताकि जांचे गए नमूने के भीतर प्रतिदीप्ति पदार्थ उत्तेजना प्रकाश की आवश्यक तीव्रता प्राप्त कर सके। उसी समय, प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी में एक संगत फ़िल्टर सिस्टम होना चाहिए। प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी प्रतिदीप्ति ऊतक रसायन विज्ञान के लिए मूल उपकरण है। यह अल्ट्रा-उच्च दबाव प्रकाश स्रोत, फिल्टर सिस्टम (उत्तेजना और दमन फिल्टर प्लेट सहित), ऑप्टिकल सिस्टम और फोटोग्राफिक सिस्टम और अन्य प्रमुख घटकों से बना है, प्रतिदीप्ति उत्सर्जित करने के लिए नमूने को उत्तेजित करने के लिए प्रकाश की एक निश्चित तरंग दैर्ध्य का उपयोग होता है।
1. प्रतिदीप्ति उत्तेजना का तरीका: प्रकाश की तरंग दैर्ध्य सीमा के अनुसार यूवी उत्तेजना विधि (पराबैंगनी रोशनी का उपयोग करके) और बीवी उत्तेजना विधि (नीले बैंगनी प्रकाश का उपयोग करके) दो प्रकार की यूवी उत्तेजना विधि उत्तेजना के लिए पराबैंगनी प्रकाश के पास 400 एनएम से कम है। इस विधि में कोई दृश्यमान उत्तेजना प्रकाश नहीं है, इसलिए मनाया गया प्रतिदीप्ति डाई के अंतर्निहित प्रतिदीप्ति को दर्शाता है, और पृष्ठभूमि ऊतक के स्व-प्रतिदीप्ति से नमूने पर विशिष्ट प्रतिदीप्ति को भेद करना आसान है।
2. बी.वी. उत्तेजना विधि: उत्तेजना के लिए विधि पराबैंगनी से नीली रोशनी तक 404nm, 434nm पर केंद्रित है। यह विधि नमूने को विकिरणित करने के लिए नीली रोशनी का उपयोग करती है, इसलिए प्रतिदीप्ति अवलोकन प्रणाली के कट-ऑफ फ़िल्टर को एक ऐसे फ़िल्टर का उपयोग करना चाहिए जो नीली रोशनी को पूरी तरह से अवरुद्ध कर सके और वांछित हरे और पीले प्रतिदीप्ति को पर्याप्त रूप से पारित कर सके। फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी विधि के लिए फ्लोरोसेंट पिगमेंट। चूंकि उत्तेजना प्रकाश के अधिकतम अवशोषण की तरंग दैर्ध्य और प्रतिदीप्ति के अधिकतम उत्सर्जन की तरंग दैर्ध्य एक दूसरे के करीब हैं, इसलिए बी.वी. उत्तेजना विधि में उपयोग किए जाने वाले फ़िल्टर तेज कट-ऑफ फ़िल्टर होने चाहिए। यह विधि उत्तेजना प्रकाश के रूप में नीली रोशनी का उपयोग करती है, इसलिए फ्लोरोक्रोम की अवशोषण दक्षता अधिक होती है और एक उज्जवल छवि प्राप्त की जा सकती है। नुकसान यह है कि 500 एनएम से नीचे प्रतिदीप्ति नहीं देखी जा सकती है, और 500 एनएम से ऊपर पूरी छवि पीली दिखाई देती है। फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी विधि में, अधिकांश विशिष्टता का आकलन फ्लोरोक्रोम के अद्वितीय रंग से किया जाता है, इसलिए ऊपर वर्णित बी.वी. उत्तेजना विधि के नुकसान सूक्ष्म विशिष्टता पर चर्चा करते समय अत्यंत प्रभावशाली होते हैं।
