सूक्ष्मदर्शी से सूक्ष्मजीवों की सीधी गिनती
प्रायोगिक सिद्धांत
हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके माइक्रोस्कोप के नीचे सीधी गिनती आमतौर पर इस्तेमाल की जाने वाली माइक्रोबियल गिनती विधि है। इस पद्धति का लाभ यह है कि यह सहज और तेज़ है। हेमोसाइटोमीटर के स्लाइड और कवर ग्लास के बीच गिनती कक्ष में उचित रूप से पतला जीवाणु निलंबन (या बीजाणु निलंबन) रखें, और माइक्रोस्कोप के नीचे गिनती करें। चूँकि गिनती कक्ष का आयतन निश्चित है (0.1mm2), इसे माइक्रोस्कोप के तहत देखे गए सूक्ष्मजीवों की संख्या के अनुसार प्रति इकाई आयतन में सूक्ष्मजीवों की कुल संख्या में परिवर्तित किया जा सकता है। चूँकि यह विधि जीवित और मृत जीवाणुओं का योग गिनती है, इसलिए इसे कुल जीवाणु गणना विधि भी कहा जाता है।
हेमोसाइटोमीटर आमतौर पर एक विशेष ग्लास स्लाइड होती है जिस पर चार खांचे तीन प्लेटफॉर्म बनाते हैं। बीच में मंच को एक छोटे क्षैतिज खांचे द्वारा दो हिस्सों में विभाजित किया गया है। मंच पर प्रत्येक तरफ एक ग्रिड उकेरा गया है। प्रत्येक ग्रिड को नौ बड़े वर्गों में विभाजित किया गया है। बीच में बड़ा वर्ग मतगणना कक्ष है। सूक्ष्मजीवों की गिनती गिनती कक्ष में की जाती है। रक्त कोशिका गणना बोर्ड की संरचना चित्र Ⅷ-1 में दिखाई गई है।
मतगणना कक्ष के पैमाने में आम तौर पर दो विशिष्टताएँ होती हैं, एक यह कि एक बड़े वर्ग को 16 मध्य वर्गों में विभाजित किया जाता है, और प्रत्येक मध्य वर्ग को 25 छोटे वर्गों में विभाजित किया जाता है (चित्र Ⅷ-2); दूसरा एक बड़ा वर्ग है. वर्ग को 25 मध्य वर्गों में विभाजित किया गया है, और प्रत्येक मध्य वर्ग को 16 छोटे वर्गों में विभाजित किया गया है (चित्र Ⅷ-1, सी)। लेकिन इससे कोई फर्क नहीं पड़ता कि यह किस प्रकार का काउंटिंग बोर्ड है, प्रत्येक बड़े वर्ग में छोटे वर्गों की संख्या समान होती है, यानी 16×25=400 छोटे वर्ग, जैसा कि चित्र Ⅷ-2 में दिखाया गया है।
प्रत्येक बड़े वर्ग की भुजा की लंबाई 1 मिमी है, और प्रत्येक बड़े वर्ग का क्षेत्रफल 1 मिमी2 है। कवर ग्लास को ढकने के बाद, स्लाइड ग्लास और कवर ग्लास के बीच की ऊंचाई 0.1 मिमी है, इसलिए गिनती कक्ष का आयतन 0.1 मिमी3 है।
गिनती करते समय, आमतौर पर पांच मध्य ग्रिड में बैक्टीरिया की कुल संख्या की गणना करें, फिर प्रत्येक मध्य ग्रिड का औसत मूल्य प्राप्त करें, और फिर एक बड़े ग्रिड में बैक्टीरिया की कुल संख्या प्राप्त करने के लिए 16 या 25 से गुणा करें, और फिर इसे परिवर्तित करें। 1 मिलीलीटर जीवाणु समाधान में बैक्टीरिया की कुल संख्या।
प्रयोगशाला के उपकरण
हेमोसाइटोमीटर, माइक्रोस्कोप, कवरस्लिप, बाँझ केशिका;
प्रायोगिक सामग्री
सैक्रोमाइसेस सेरेविसिया निलंबन
प्रायोगिक प्रक्रिया (माइक्रोबियल माइक्रोस्कोप प्रत्यक्ष गिनती विधि)
1. तनुकरण
सैक्रोमाइसेस सेरेविसिया सस्पेंशन को उचित रूप से पतला करें। यदि जीवाणु घोल गाढ़ा नहीं है, तो इसे पतला करने की आवश्यकता नहीं है।
2. सूक्ष्मदर्शी गणना कक्ष
नमूने जोड़ने से पहले, काउंटिंग प्लेट के काउंटिंग कक्ष का सूक्ष्म निरीक्षण करें। यदि गंदगी है तो गिनती से पहले उसे साफ करना होगा।
3. नमूना जोड़ें
साफ और सूखी हीमोसाइटोमीटर प्लेट को एक कवर ग्लास से ढक दें, और फिर एक स्टेराइल फाइन-माउथ ड्रॉपर का उपयोग करके कवर ग्लास के किनारे से पतला सैक्रोमाइसेस सेरेविसिया घोल की एक छोटी बूंद डालें (बहुत ज्यादा नहीं), ताकि बैक्टीरिया का घोल बन जाए। अंतराल के साथ अंतराल के करीब है। केशिका परासरण अपने आप गिनती कक्ष में प्रवेश करती है, और सामान्य गिनती कक्ष जीवाणु तरल से भरा जा सकता है। सावधान रहें कि हवा के बुलबुले न हों।
4. माइक्रोस्कोप गिनती
5 मिनट तक आराम करने के बाद, हेमोसाइटोमीटर को माइक्रोस्कोप के मंच पर रखें, गिनती कक्ष का स्थान जानने के लिए पहले कम पावर लेंस का उपयोग करें, और फिर गिनती के लिए उच्च पावर लेंस पर स्विच करें। यदि गिनती से पहले यह पाया जाता है कि जीवाणु घोल बहुत गाढ़ा या बहुत पतला है, तो गिनती से पहले तनुकरण को फिर से समायोजित करना आवश्यक है। आम तौर पर, नमूना तनुकरण के लिए प्रत्येक कोशिका में लगभग 5-10 बैक्टीरिया की आवश्यकता होती है। प्रत्येक गिनती कक्ष गिनती के लिए 5 मध्य ग्रिड (वैकल्पिक 4 कोने और केंद्रीय ग्रिड) में बैक्टीरिया का चयन करता है। ग्रिड लाइन पर बैक्टीरिया आमतौर पर केवल ऊपरी और दाहिनी रेखाओं पर गिने जाते हैं। यीस्ट बडिंग के मामले में, जब बड बॉडी का आकार मातृ कोशिका के आधे तक पहुंच जाता है, तो दो बैक्टीरिया की गिनती करें। दो गिनती कक्षों में गिने गए मानों से नमूने में जीवाणु सामग्री की गणना करने के लिए एक नमूने की गणना करें।
5. हेमोसाइटोमीटर की सफाई
उपयोग के बाद, नल पर रक्त कोशिका गिनती प्लेट को पानी के जेट से धोएं, इसे कठोर वस्तुओं से न धोएं, और धोने के बाद इसे स्वयं या हेयर ड्रायर से सुखाएं। सूक्ष्म परीक्षण, निरीक्षण करें कि क्या प्रत्येक कोशिका में अवशिष्ट बैक्टीरिया या अन्य तलछट हैं। यदि यह साफ नहीं है तो इसे साफ होने तक बार-बार धोना चाहिए।
