प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी और साधारण प्रकाशीय सूक्ष्मदर्शी के बीच अंतर और विशेषताएं
प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी साधारण प्रकाशीय सूक्ष्मदर्शी से भिन्न है। यह साधारण प्रकाश स्रोत की रोशनी के माध्यम से नमूने का निरीक्षण नहीं करता है। इसके बजाय, यह माइक्रोस्कोप के नीचे नमूने में प्रतिदीप्ति पदार्थ को उत्तेजित करने के लिए एक निश्चित तरंग दैर्ध्य (आमतौर पर पराबैंगनी प्रकाश, नीला-बैंगनी प्रकाश) के प्रकाश का उपयोग करता है, जिससे यह प्रतिदीप्ति उत्सर्जित करता है। इसलिए, प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी का प्रकाश स्रोत प्रत्यक्ष रोशनी के रूप में काम नहीं करता है, बल्कि एक ऊर्जा स्रोत के रूप में काम करता है जो नमूने की आंतरिक प्रतिदीप्ति पदार्थ को उत्तेजित करता है। हम नमूने का निरीक्षण क्यों कर सकते हैं इसका कारण प्रकाश स्रोत की रोशनी नहीं है, बल्कि नमूने में प्रतिदीप्ति पदार्थ द्वारा उत्तेजित प्रकाश ऊर्जा को अवशोषित करने के कारण होने वाली प्रतिदीप्ति घटना है। यह देखा जा सकता है कि प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी की मुख्य विशेषता यह है कि इसका प्रकाश स्रोत एक विशिष्ट तरंग दैर्ध्य सीमा में बड़ी मात्रा में उत्तेजना प्रकाश की आपूर्ति कर सकता है, ताकि परीक्षण के तहत नमूने में प्रतिदीप्ति पदार्थ उत्तेजना प्रकाश की आवश्यक तीव्रता प्राप्त कर सकें। उसी समय, प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी में संगत फ़िल्टर सिस्टम होना चाहिए। प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी उन्नत प्रतिदीप्ति ऊतक रसायन विज्ञान के लिए एक आवश्यक उपकरण है। यह अल्ट्रा-हाई-प्रेशर लाइट सोर्स, फिल्टर सिस्टम (उत्तेजना और दमन फिल्टर प्लेट सहित), ऑप्टिकल सिस्टम और फोटोग्राफी सिस्टम से बना है। यह प्रतिदीप्ति उत्सर्जित करने के लिए नमूने को उत्तेजित करने के लिए एक निश्चित तरंग दैर्ध्य के प्रकाश का उपयोग करता है।
1. प्रतिदीप्ति को उत्तेजित करने के तरीके: प्रकाश की तरंग दैर्ध्य सीमा के अनुसार, इसे दो प्रकारों में विभाजित किया जाता है: यूवी उत्तेजना विधि (पराबैंगनी रोशनी विधि का उपयोग करके) और बीवी उत्तेजना विधि (नीली-बैंगनी रोशनी का उपयोग करके)। यूवी उत्तेजना विधि उत्तेजना के लिए 400nm से कम पराबैंगनी प्रकाश का उपयोग करती है। इस विधि में कोई दृश्यमान उत्तेजना प्रकाश नहीं है, इसलिए देखा गया प्रतिदीप्ति डाई के अंतर्निहित प्रतिदीप्ति को दर्शाता है, जिससे नमूने पर विशिष्ट प्रतिदीप्ति को पृष्ठभूमि ऊतक के ऑटोफ्लोरोसेंस से अलग करना आसान हो जाता है।
2. बी.वी. उत्तेजना विधि: 404nm और 434nm पर केंद्रित पराबैंगनी से नीली रोशनी तक उत्तेजना। यह विधि नमूने को रोशन करने के लिए नीली रोशनी का उपयोग करती है, इसलिए प्रतिदीप्ति अवलोकन प्रणाली के कट-ऑफ फ़िल्टर को एक ऐसे फ़िल्टर का उपयोग करना चाहिए जो नीली रोशनी को पूरी तरह से ब्लॉक कर सके और आवश्यक हरे और पीले प्रतिदीप्ति को पूरी तरह से पास कर सके। फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी विधियों में उपयोग किए जाने वाले फ्लोरोसेंट रंग। उत्तेजना प्रकाश की अधिकतम अवशोषण तरंगदैर्ध्य और प्रतिदीप्ति की अधिकतम उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य अपेक्षाकृत करीब हैं, इसलिए बी.वी. उत्तेजना विधि में उपयोग किए जाने वाले फ़िल्टर को एक तेज कटऑफ फ़िल्टर का उपयोग करना चाहिए। यह विधि उत्तेजना प्रकाश के रूप में नीली रोशनी का उपयोग कर सकती है, इसलिए फ्लोरोसेंट पिगमेंट की अवशोषण दक्षता अधिक होती है और उज्जवल चित्र प्राप्त किए जा सकते हैं। नुकसान यह है कि 500nm से नीचे का प्रतिदीप्ति नहीं देखा जा सकता है, जबकि 500nm से ऊपर का प्रतिदीप्ति पूरी छवि को पीला दिखाई देता है। फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी विधि में, फ्लोरोसेंट डाई की विशिष्टता को ज्यादातर उसके अनूठे रंग से आंका जाता है। इसलिए, सूक्ष्म विशिष्टता पर चर्चा करते समय, बी.वी. उत्तेजना विधि की उपर्युक्त कमियों का अक्सर बहुत प्रभाव पड़ता है।
