प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी और सामान्य सूक्ष्मदर्शी के बीच अंतर
मैंने हाल ही में चूहों के कुछ जमे हुए हिस्से बनाने की कोशिश की। इसके बाद, मैं एक फ्लोरोसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके देखूंगा कि मैंने जो वायरस इंजेक्ट किया है, वह मेरे इच्छित मस्तिष्क क्षेत्र में है या नहीं। फ्लोरोसेंस माइक्रोस्कोपी के कुछ बुनियादी सिद्धांतों को संक्षेप में सीखने की आवश्यकता है, और मैं उन्हें यहाँ साझा करूँगा।
प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी पराबैंगनी प्रकाश का उपयोग प्रकाश स्रोत के रूप में निरीक्षण की जा रही वस्तु को रोशन करने के लिए करते हैं, जिससे वस्तु प्रकाश उत्सर्जित करती है, और फिर माइक्रोस्कोप के नीचे वस्तु का निरीक्षण करती है। इसका उपयोग मुख्य रूप से इम्यूनोफ्लोरेसेंस कोशिकाओं के लिए किया जाता है। यह मुख्य रूप से एक प्रकाश स्रोत, एक फिल्टर प्लेट प्रणाली और एक ऑप्टिकल प्रणाली से बना होता है। नमूने की फ्लोरोसेंट छवि ऐपिस और ऑब्जेक्टिव लेंस के आवर्धन के माध्यम से देखी जाती है। आइए एक फ्लोरोसेंस माइक्रोस्कोप और एक साधारण ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के बीच अंतर पर एक नज़र डालें।
1. प्रकाश व्यवस्था का तरीका देखें
प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी की प्रकाश विधि आम तौर पर एपी-रोशनी है, जिसका अर्थ है कि प्रकाश स्रोत को ऑब्जेक्टिव लेंस के माध्यम से परीक्षण नमूने पर रखा जाता है।
2. संकल्प को देखो
प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी प्रकाश स्रोत के रूप में पराबैंगनी प्रकाश का उपयोग करते हैं, जिसकी तरंगदैर्घ्य छोटी होती है, लेकिन साधारण प्रकाशीय सूक्ष्मदर्शी की तुलना में इसका रिजोल्यूशन अधिक होता है।
3. फिल्टर में अंतर
प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी दो विशेष फिल्टरों का उपयोग करते हैं, एक का उपयोग प्रकाश स्रोत के सामने दृश्य प्रकाश को छानने के लिए किया जाता है, और दूसरे का उपयोग ऑब्जेक्टिव लेंस और ऐपिस के बीच पराबैंगनी किरणों को छानने के लिए किया जाता है, जो मानव आंखों की रक्षा कर सकता है।
प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी भी एक प्रकार का ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप है। इसका मुख्य कारण यह है कि प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी द्वारा उत्तेजित तरंगदैर्घ्य छोटा होता है, इसलिए यह प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी और साधारण सूक्ष्मदर्शी के बीच संरचना और उपयोग में अंतर की ओर जाता है। अधिकांश प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी में कमजोर प्रकाश को पकड़ने का अच्छा कार्य होता है। इसलिए इसकी इमेजिंग क्षमता अत्यंत कमजोर प्रतिदीप्ति के तहत भी अच्छी होती है। हाल के वर्षों में प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी के निरंतर सुधार के साथ, शोर भी बहुत कम हो गया है। इसलिए, अधिक से अधिक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी का उपयोग किया जा रहा है।
दो-फोटोन प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के बारे में जानकारी
दो-फोटोन उत्तेजना का मूल सिद्धांत है: उच्च फोटॉन घनत्व की स्थिति में, फ्लोरोसेंट अणु एक ही समय में दो लंबी-तरंग दैर्ध्य वाले फोटॉनों को अवशोषित कर सकते हैं, और एक छोटे तथाकथित उत्तेजित अवस्था जीवनकाल के बाद, एक छोटे तरंग दैर्ध्य वाले फोटॉन का उत्सर्जन करते हैं। ;प्रभाव फ्लोरोसेंट अणुओं को उत्तेजित करने के लिए आधी लंबी तरंग दैर्ध्य वाले फोटॉन का उपयोग करने के समान है। दो-फोटोन उत्तेजना के लिए उच्च फोटॉन घनत्व की आवश्यकता होती है। कोशिकाओं को नुकसान न पहुंचाने के लिए, दो-फोटोन माइक्रोस्कोप उच्च-ऊर्जा मोड-लॉक पल्स लेजर का उपयोग करते हैं। यह लेजर उच्च शिखर ऊर्जा और कम औसत ऊर्जा के साथ लेजर प्रकाश का उत्सर्जन करता है, जिसमें केवल 100 फेमटोसेकंड की पल्स चौड़ाई और 80 से 100 मेगाहर्ट्ज की आवृत्ति होती है दो-फोटोन उत्तेजना केवल ऑब्जेक्टिव लेंस के फोकस पर होती है, इसलिए दो-फोटोन माइक्रोस्कोप को कॉन्फोकल पिनहोल की आवश्यकता नहीं होती है, जिससे प्रतिदीप्ति पहचान दक्षता में सुधार होता है।
सामान्य प्रतिदीप्ति घटना में, उत्तेजना प्रकाश के कम फोटॉन घनत्व के कारण, एक फ्लोरोसेंट अणु एक ही समय में केवल एक फोटॉन को अवशोषित कर सकता है और फिर विकिरण संक्रमण के माध्यम से एक प्रतिदीप्ति फोटॉन उत्सर्जित कर सकता है। यह एकल-फोटॉन प्रतिदीप्ति है। प्रकाश स्रोत के रूप में लेजर का उपयोग करके प्रतिदीप्ति उत्तेजना प्रक्रिया के लिए, दो-फोटॉन या यहां तक कि बहु-फोटॉन प्रतिदीप्ति घटना हो सकती है। इस मामले में, उपयोग किए जाने वाले उत्तेजना प्रकाश स्रोत की तीव्रता अधिक होती है, और फोटॉन घनत्व फ्लोरोसेंट अणुओं के लिए एक ही समय में दो फोटॉन अवशोषित करने की आवश्यकता को पूरा करता है। उत्तेजना प्रकाश स्रोतों के रूप में साधारण लेजर का उपयोग करने की प्रक्रिया में, फोटॉन घनत्व अभी भी दो-फोटॉन अवशोषण का उत्पादन करने के लिए पर्याप्त नहीं है। फेमटोसेकंड पल्स लेजर का आमतौर पर उपयोग किया जाता है, और उनकी तात्कालिक शक्ति मेगावाट स्तर तक पहुंच सकती है। इसलिए, दो-फोटॉन प्रतिदीप्ति की तरंग दैर्ध्य उत्तेजना प्रकाश की तरंग दैर्ध्य से कम होती है, जो अर्ध-उत्तेजना तरंग दैर्ध्य उत्तेजना द्वारा उत्पन्न प्रभाव के बराबर होती है।
