कन्फोकल माइक्रोस्कोपी का विकास रुझान
तकनीकी स्तर पर बेहतर अवलोकन परिणाम प्राप्त करने के लिए, कन्फोकल माइक्रोस्कोपी रिज़ॉल्यूशन में सुधार, फोटोटॉक्सिसिटी को कम करने, स्कैनिंग गति बढ़ाने, मोटे नमूनों का अवलोकन करने और विवो में अवलोकन करने के पहलुओं से तकनीकी स्तर में सुधार करने पर ध्यान केंद्रित करता है। फिलहाल यह Z इफेक्टिव है. कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी तकनीक के लिए जेडडीए को जो बढ़ावा देता है वह अल्ट्रा-हाई रेजोल्यूशन माइक्रोस्कोपी है, जो ऑप्टिकल सीमा को तोड़ता है और शोधकर्ताओं को बेहतर सेल संरचनाएं प्राप्त करने की अनुमति देता है, जो शोधकर्ताओं की जीवन गतिविधियों की गहरी समझ के लिए अनुकूल है। कन्फोकल माइक्रोस्कोपी तकनीक का अगला शोध फोकस निम्नलिखित बिंदुओं पर केंद्रित होना चाहिए:
1. तेज़ स्कैनिंग गति
वर्तमान में, कन्फोकल स्कैनिंग गति स्कैनिंग उपकरण की यांत्रिक संरचना द्वारा सीमित है, और तेज स्कैनिंग गति प्राप्त करने के लिए केवल रिज़ॉल्यूशन का त्याग किया जा सकता है। कई जैविक प्रक्रियाएँ इतनी तीव्र होती हैं कि उनका पता नहीं चल पाता।
2. अधिक उत्तम अल्ट्रा-हाई रेजोल्यूशन तकनीक
वर्तमान में, अल्ट्रा-उच्च रिज़ॉल्यूशन प्रौद्योगिकियों में 20 से 200 एनएम तक के रिज़ॉल्यूशन वाले STORM, PALM, STED और SSIM शामिल हैं, लेकिन प्रत्येक तकनीक में कुछ दोष होते हैं, जैसे नमूना प्रसंस्करण, Z-अक्ष दिशा, फोटोटॉक्सिसिटी, आदि। लगभग पूर्ण नहीं है, और वास्तविक अवलोकन में सीमा रिज़ॉल्यूशन प्राप्त करना अक्सर मुश्किल होता है।
3. मजबूत अनुकूलता
कन्फोकल माइक्रोस्कोपी तकनीक में विभिन्न प्रकार की उत्तेजना विधियां शामिल हैं, जैसे कि ऊपर उल्लिखित मल्टीफोटोन और लाइट शीट अवलोकन, और सुसंगत एंटी-स्टोक्स रमन स्कैटरिंग सैद्धांतिक रूप से लेजर सिस्टम का एक सेट साझा कर सकता है। सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी को सफेद लेजर तकनीक के साथ जोड़ा जा सकता है। हालाँकि, विभिन्न कंपनियों के पेटेंट मुद्दों के कारण, पूर्णता और अनुकूलता के मामले में अभी भी सुधार की गुंजाइश है, और वर्तमान उपकरण एप्लिकेशन के तकनीकी लाभों को पूर्ण भूमिका नहीं दे सकते हैं।
कन्फोकल माइक्रोस्कोपी के सिद्धांत
कन्फोकल माइक्रोस्कोप चार भागों से बना है: माइक्रोस्कोप ऑप्टिकल सिस्टम, लेजर प्रकाश स्रोत, स्कैनर और डिटेक्शन और प्रोसेसिंग सिस्टम। यह प्रकाश स्रोत के रूप में अच्छे सामंजस्य के साथ लेजर का उपयोग करता है। यह पारंपरिक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के आधार पर संयुग्मित फोकसिंग सिद्धांत और उपकरण को अपनाता है, और छवि प्रसंस्करण के लिए कंप्यूटर अवलोकन, विश्लेषण और आउटपुट सिस्टम का एक सेट का उपयोग करता है।
लेजर स्कैनिंग बीम एक बिंदु प्रकाश स्रोत बनाने के लिए झंझरी के पिनहोल से होकर गुजरती है, जो बीम स्प्लिटर के माध्यम से ऑब्जेक्टिव लेंस पर प्रतिबिंबित होती है, नमूने पर केंद्रित होती है और स्कैन की जाती है। नमूना उत्तेजित होने के बाद, उत्सर्जित प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोप पर लौट आती है और इसे डिटेक्शन पिनहोल में इकट्ठा करती है, और फिर इसे फोटोमल्टीप्लायर ट्यूब द्वारा विद्युत संकेत में परिवर्तित किया जाता है और एक स्पष्ट फोकल प्लेन छवि प्रदर्शित करने के लिए कंप्यूटर में प्रेषित किया जाता है। उत्तेजना प्रकाश झंझरी के पिनहोल के माध्यम से नमूने पर केंद्रित होता है, और प्रतिदीप्ति वस्तुनिष्ठ लेंस के माध्यम से पिनहोल पर केंद्रित होता है। यह प्रक्रिया दो फोकसिंग बनाती है, इसलिए इसे कन्फोकल माइक्रोस्कोप कहा जाता है।
साधारण जैविक नमूनों में एक जटिल संरचना और एक निश्चित मोटाई होती है। जब एक साधारण प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप से देखा जाता है, तो नमूने द्वारा उत्सर्जित प्रतिदीप्ति एक दूसरे के साथ ओवरलैप हो जाती है, और छवि रिज़ॉल्यूशन बहुत कम हो जाता है।
कन्फोकल माइक्रोस्कोप की कन्फोकल इमेजिंग, फोकल प्लेन के बाहर आवारा प्रकाश और गैर-माप प्रकाश को डिटेक्टर में प्रवेश करने से प्रभावी ढंग से दबा सकती है, एकल फोकल प्लेन इमेजिंग का एहसास कर सकती है, और रिज़ॉल्यूशन में काफी सुधार कर सकती है। जब चरण क्षैतिज दिशा में समान रूप से चलता है, तो यह एक स्पष्ट एकल-परत छवि बना सकता है, और ऊर्ध्वाधर दिशा में, यह विभिन्न गहराई पर नमूने की परत-दर-परत स्कैनिंग का एहसास कर सकता है, और त्रि-आयामी संरचना प्राप्त कर सकता है त्रि-आयामी पुनर्निर्माण के बाद नमूने का, जो तथाकथित "ऑप्टिकल सीटी" है। नमूने को एक फ्लोरोसेंट जांच के साथ लेबल किया जाता है और फिर एक कन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ देखा जाता है। न केवल विभिन्न स्थिर कोशिकाओं और ऊतक संरचनाओं का अवलोकन किया जा सकता है, बल्कि जीवित कोशिकाओं की आकृति विज्ञान, संरचना और आयनों को भी गुणात्मक और मात्रात्मक रूप से देखा और मापा जा सकता है।
