कन्फोकल माइक्रोस्कोप और साधारण ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के बीच तुलना
सामान्य ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप
सामान्य जैविक माइक्रोस्कोप में तीन भाग होते हैं, अर्थात्: ① प्रकाश स्रोत और कंडेनसर सहित रोशनी प्रणाली; ② ऑप्टिकल एम्प्लीफिकेशन सिस्टम, जिसमें ऑब्जेक्टिव लेंस और ऐपिस शामिल हैं, माइक्रोस्कोप का मुख्य भाग है। गोलाकार विपथन और रंगीन विपथन को खत्म करने के लिए, ऐपिस और ऑब्जेक्टिव लेंस दोनों जटिल लेंस समूहों से बने होते हैं; (3) यांत्रिक उपकरण, जिसका उपयोग सामग्री को ठीक करने और सुविधाजनक अवलोकन के लिए किया जाता है।
माइक्रोस्कोप की छवि स्पष्ट है या नहीं यह न केवल आवर्धन पर निर्भर करता है, बल्कि माइक्रोस्कोप के रिज़ॉल्यूशन पर भी निर्भर करता है। रिज़ॉल्यूशन से तात्पर्य माइक्रोस्कोप (या वह स्थान जहां मानव आंखें लक्ष्य से 25 सेमी दूर हैं) की ऑब्जेक्ट ज़ुई के छोटे अंतराल को अलग करने की क्षमता से है। रिज़ॉल्यूशन प्रकाश की तरंग दैर्ध्य, एपर्चर अनुपात और माध्यम के अपवर्तक सूचकांक पर निर्भर करता है, जिसे सूत्र द्वारा व्यक्त किया जाता है:
आर=0.61λ /N．A． N．A．＝ｎsin /2
कहां: n= माध्यम का अपवर्तनांक;=दर्पण कोण (लेंस एपर्चर के लिए नमूने का प्रारंभिक कोण), और NA= संख्यात्मक एपर्चर। दर्पण का कोण सदैव 180 से कम होता है? इसलिए, sina/2 का ज़ूई मान 1 से कम होना चाहिए।
ऑप्टिकल लेंस बनाने के लिए उपयोग किए जाने वाले ग्लास का अपवर्तक सूचकांक 1.65 ~ 1.78 है, और उपयोग किए गए माध्यम का अपवर्तक सूचकांक ग्लास के करीब है, बेहतर है। शुष्क वस्तुनिष्ठ लेंस के लिए, माध्यम हवा है, और एपर्चर अनुपात आम तौर पर 0 होता है। 05 ~ 0.95; तेल लेंस माध्यम के रूप में सुगंधित डामर का उपयोग करता है, और लेंस खोलने की दर 1.5 के करीब हो सकती है।
साधारण प्रकाश की तरंग दैर्ध्य 4 {{2} 0 ~ 700 एनएम है, इसलिए माइक्रोस्कोप का रिज़ॉल्यूशन 0.2μm से कम नहीं है, और मानव आंख का रिज़ॉल्यूशन 0.2 मिमी है, इसलिए ज़ुई का बड़ा आवर्धन डिज़ाइन किया गया है सामान्य माइक्रोस्कोप आमतौर पर 1000X x होता है।
आपको कन्फोकल माइक्रोस्कोप की आवश्यकता क्यों है?
1. ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप को हमारे महान पूर्ववर्तियों के प्रयासों और सुधार के माध्यम से परिपूर्ण किया गया है। वास्तव में, साधारण सूक्ष्मदर्शी हमें आसानी से और शीघ्रता से सुंदर सूक्ष्म चित्र प्रदान कर सकते हैं। हालाँकि, एक ऐसी घटना घटी जिसने इस लगभग पूर्ण माइक्रोस्कोप की दुनिया में क्रांतिकारी नवाचार लाया, जो कि "लेजर स्कैनिंग कन्फोकल माइक्रोस्कोप" का आविष्कार है। इस नए माइक्रोस्कोप की विशेषता एक ऑप्टिकल सिस्टम को अपनाना है जो केवल उस तल पर छवि जानकारी निकालता है जहां फोकस केंद्रित है, और फोकस बदलते समय प्राप्त जानकारी को छवि मेमोरी में पुनर्स्थापित करता है, ताकि पूर्ण त्रि-आयामी जानकारी के साथ एक ज्वलंत छवि प्राप्त हो सके प्राप्त किया जा सकता है। इस विधि से सतह के आकार के बारे में वह जानकारी आसानी से प्राप्त की जा सकती है जिसकी पुष्टि साधारण सूक्ष्मदर्शी से नहीं की जा सकती। इसके अलावा, सामान्य ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के लिए, "रिज़ॉल्यूशन में सुधार" और "फोकस की गहराई को गहरा करना" विरोधाभासी स्थितियाँ हैं, विशेष रूप से उच्च आवर्धन पर, लेकिन कन्फोकल माइक्रोस्कोप के लिए, यह समस्या हल हो गई है।
2. कन्फोकल ऑप्टिकल सिस्टम के लाभ
कन्फोकल ऑप्टिकल सिस्टम नमूना बिंदु को रोशन करता है, और परावर्तित प्रकाश भी बिंदु रिसेप्टर्स द्वारा प्राप्त किया जाता है। जब नमूना फोकस स्थिति में रखा जाता है, तो लगभग सभी परावर्तित प्रकाश फोटोरिसेप्टर तक पहुंच सकता है, लेकिन जब नमूना फोकस से भटक जाता है, तो परावर्तित प्रकाश फोटोरिसेप्टर तक नहीं पहुंच पाता है। कहने का तात्पर्य यह है कि, कन्फोकल ऑप्टिकल सिस्टम में, केवल वह छवि जो फोकस के साथ मेल खाती है, आउटपुट होगी, और फेसुला और बेकार बिखरी हुई रोशनी को परिरक्षित किया जाएगा।
3. लेजर का उपयोग क्यों करें?
कन्फोकल ऑप्टिकल प्रणाली में, नमूना प्रकाशित होता है और परावर्तित प्रकाश भी एक बिंदु फोटोरिसेप्टर द्वारा प्राप्त किया जाता है। अतः बिंदु प्रकाश स्रोत आवश्यक हो जाता है। लेजर एक अत्यंत बिंदु प्रकाश स्रोत से संबंधित है। ज्यादातर मामलों में, कन्फोकल माइक्रोस्कोप का प्रकाश स्रोत लेजर प्रकाश स्रोत को अपनाता है। इसके अलावा, लेजर की विशेषताएं, जैसे मोनोक्रोमैटिकिटी, डायरेक्टिविटी और उत्कृष्ट बीम आकार भी इसके व्यापक उपयोग के महत्वपूर्ण कारण हैं।
4. हाई-स्पीड स्कैनिंग पर आधारित वास्तविक समय का अवलोकन संभव हो जाता है।
लेजर स्कैनिंग में, ध्वनिक ऑप्टिकल डिफ्लेक्टर (एओ प्राइम तत्व) का उपयोग क्षैतिज दिशा में किया जाता है और सर्वो गैल्वेनो-मिरर का उपयोग ऊर्ध्वाधर दिशा में किया जाता है। क्योंकि ध्वनिक ऑप्टिकल विक्षेपण इकाई में कोई यांत्रिक कंपन भाग नहीं है, यह उच्च गति से स्कैन कर सकता है, और मॉनिटरिंग स्क्रीन पर वास्तविक समय में निरीक्षण करना संभव है। इस कैमरे की उच्च गति एक बहुत ही महत्वपूर्ण परियोजना है जो सीधे फोकस करने और स्थिति पुनर्प्राप्ति की गति को प्रभावित करती है।
5. फोकस स्थिति और चमक के बीच संबंध
कन्फोकल ऑप्टिकल सिस्टम में, जब नमूना सही ढंग से फोकस स्थिति में रखा जाता है, तो चमक बड़ी होती है, और इसके पहले और बाद में, इसकी चमक तेजी से गिर जाएगी (चित्रा 4 में ठोस रेखा)। फोकल तल की यह संवेदनशील चयनात्मकता कन्फोकल माइक्रोस्कोप की ऊंचाई दिशा को मापने और फोकल गहराई का विस्तार करने का सिद्धांत भी है। इसके विपरीत, सामान्य ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप में फोकस स्थिति से पहले और बाद में स्पष्ट चमक परिवर्तन नहीं होता है (चित्रा 4 में बिंदीदार रेखा)।
6. उच्च कंट्रास्ट और उच्च रिज़ॉल्यूशन
सामान्य ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप में, फोकस से भटकने वाली परावर्तित रोशनी हस्तक्षेप करेगी, और यह फोकस इमेजिंग भाग के साथ ओवरलैप हो जाएगी, जिससे छवि कंट्रास्ट कम हो जाएगा। इसके विपरीत, कन्फोकल ऑप्टिकल सिस्टम में, फोकस के बाहर बिखरी हुई रोशनी और ऑब्जेक्टिव लेंस के अंदर बिखरी हुई रोशनी लगभग पूरी तरह से हटा दी जाती है, इसलिए बहुत अधिक कंट्रास्ट वाली छवि प्राप्त की जा सकती है। इसके अलावा, क्योंकि प्रकाश वस्तुनिष्ठ लेंस से दो बार गुजरता है, बिंदु छवि पहले तेज होती है, और माइक्रोस्कोप का रिज़ॉल्यूशन भी बेहतर होता है।
7. ऑप्टिकल स्थानीयकरण समारोह
कन्फोकल ऑप्टिकल सिस्टम में, फोकल बिंदु के अलावा अन्य भाग का परावर्तित प्रकाश माइक्रोप्रोर्स द्वारा परिरक्षित होता है। इसलिए, त्रि-आयामी नमूने का अवलोकन करते समय, फोकस के साथ नमूने को काटने के बाद बनी छवि जैसी एक छवि बनती है (चित्रा 5)। इस प्रभाव को ऑप्टिकल स्थानीयकरण कहा जाता है, जो कन्फोकल ऑप्टिकल सिस्टम की विशेषताओं में से एक है।
8. फोकस मूविंग मेमोरी फ़ंक्शन
फोकस के बाहर तथाकथित परावर्तित प्रकाश माइक्रोप्रोर्स द्वारा परिरक्षित होता है। दूसरी ओर, यह माना जा सकता है कि कन्फोकल ऑप्टिकल सिस्टम द्वारा बनाई गई छवि के सभी बिंदु फोकस के साथ मेल खाते हैं। इसलिए, यदि त्रि-आयामी नमूना को जेड-अक्ष (ऑप्टिकल अक्ष) दिशा के साथ ले जाया जाता है, तो छवि मेमोरी में जमा और संग्रहीत हो जाएगी, और ज़ूई को अंततः पूरे नमूने और फोकस के संयोग से बनी छवि मिल जाएगी . इस प्रकार फोकस की अनंत गहराई के फ़ंक्शन को मोबाइल मेमोरी फ़ंक्शन कहा जाता है।
9. सतह आकार मापने का कार्य
फोकस मूविंग फ़ंक्शन में, ऊंचाई रिकॉर्डिंग लूप जोड़कर नमूने की सतह के आकार को गैर-संपर्क तरीके से मापा जा सकता है। इस फ़ंक्शन के आधार पर, प्रत्येक पिक्सेल में ज़ुई के बड़े चमक मूल्य द्वारा गठित जेड-अक्ष निर्देशांक को रिकॉर्ड करना संभव है, और इस जानकारी के आधार पर, नमूने की सतह के आकार से संबंधित जानकारी प्राप्त की जा सकती है।
10. उच्च परिशुद्धता सूक्ष्म आकार माप समारोह
प्रकाश प्राप्त करने वाली इकाई एक आयामी सीसीडी इमेजिंग सेंसर को अपनाती है, ताकि यह स्कैनिंग डिवाइस के स्कैनिंग झुकाव से अप्रभावित रह सके, ताकि उच्च-सटीक माप पूरा किया जा सके। इसके अलावा, क्योंकि समायोज्य फोकस गहराई के साथ फोकस मूविंग मेमोरी फ़ंक्शन को एक ही समय में अपनाया जाता है, फोकस ऑफसेट के कारण होने वाली माप त्रुटि को समाप्त किया जा सकता है।
11. त्रि-आयामी छवि विश्लेषण
सतह आकार मापने के फ़ंक्शन का उपयोग करके, नमूना सतह की त्रि-आयामी छवि आसानी से बनाई जा सकती है। इतना ही नहीं, बल्कि कई प्रकार के विश्लेषण भी किए जा सकते हैं, जैसे: सतह खुरदरापन माप, क्षेत्र, आयतन, सतह क्षेत्र, गोलाकारता, त्रिज्या, ज़ुई की लंबाई, परिधि, गुरुत्वाकर्षण का केंद्र, टोमोग्राफिक छवि, एफएफटी परिवर्तन, रेखा चौड़ाई माप वगैरह।
लेजर कन्फोकल स्कैनिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग न केवल कोशिका आकृति विज्ञान का निरीक्षण करने के लिए किया जा सकता है, बल्कि कोशिकाओं में जैव रासायनिक घटकों के मात्रात्मक विश्लेषण, ऑप्टिकल घनत्व सांख्यिकी और कोशिका आकृति विज्ञान माप के लिए भी किया जा सकता है।
