विभिन्न सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी तकनीकों की तुलना
पारंपरिक प्रकाश माइक्रोस्कोपी के लिए, प्रकाश का विवर्तन इमेजिंग रिज़ॉल्यूशन को लगभग 250 एनएम तक सीमित करता है। आज, सुपर-रिज़ॉल्यूशन तकनीकें इसे 10 से अधिक कारकों द्वारा सुधार सकती हैं। यह तकनीक मुख्य रूप से तीन तरीकों से प्राप्त की जाती है: एकल-अणु स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी, जिसमें फोटोसेंसिटिव स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (PALM) और स्टोकेस्टिक ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी (STORM) शामिल हैं; संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी (सिम); और उत्तेजित उत्सर्जन कमी माइक्रोस्कोपी (STED)। सुपर-रिज़ॉल्यूशन तकनीक कैसे चुनें, यह हर किसी की चिंता है। ब्रिटेन के ऑक्सफोर्ड विश्वविद्यालय के पोस्टडॉक्टरल शोधकर्ता मैथ्यू स्ट्रैसी कहते हैं, "दुर्भाग्य से, यह तय करने के लिए कोई सरल सिद्धांत नहीं हैं कि किस विधि का उपयोग किया जाए।" "प्रत्येक के अपने फायदे और नुकसान हैं।" वैज्ञानिक निश्चित रूप से यह भी पता लगा रहे हैं कि किसी विशेष परियोजना के लिए सही विधि का चयन कैसे किया जाए। "बायोइमेजिंग के संदर्भ में, विचार करने योग्य प्रमुख कारकों में शामिल हैं: स्थानिक और अस्थायी रिज़ॉल्यूशन, फोटोडैमेज के प्रति संवेदनशीलता, लेबलिंग क्षमता, नमूना मोटाई, और पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति या सेल ऑटोलॉगस प्रतिदीप्ति।" यह कैसे काम करता है विभिन्न सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोप अलग-अलग तरीकों से काम करते हैं। PALM और STORM के मामले में, फ्लोरोसेंट मार्करों का केवल एक छोटा सा अंश किसी निश्चित समय पर उत्तेजित या फोटोसक्रिय होता है, जिससे उच्च परिशुद्धता के साथ उनका स्वतंत्र स्थानीयकरण संभव हो पाता है। सभी फ्लोरोसेंट लेबल के साथ इस प्रक्रिया से गुजरने पर एक पूर्ण सुपर-रिज़ॉल्यूशन छवि प्राप्त होती है। रसायन विज्ञान में 2014 के नोबेल पुरस्कार विजेताओं में से एक और मैक्स प्लैंक इंस्टीट्यूट ऑफ बायोफिजिकल केमिस्ट्री के निदेशक स्टीफन हेल ने कहा: "PALM/STORM प्रणाली स्थापित करना अपेक्षाकृत आसान है, लेकिन इसे लागू करना मुश्किल है, क्योंकि फ्लोरोसेंट समूह में फोटोएक्टिवेशन क्षमता होनी चाहिए। सीमाएं नुकसान यह है कि उन्हें सेल के संदर्भ में एक एकल फ्लोरोसेंट अणु का पता लगाने की आवश्यकता होती है, और एसटीईडी की तुलना में कम विश्वसनीय होते हैं।" एसटीईडी फ्लोरोफोर को उत्तेजित करने के लिए एक लेजर पल्स का उपयोग करता है और फ्लोरोफोर को बुझाने के लिए एक अंगूठी के आकार का लेजर का उपयोग करता है, जिससे सुपर-रिज़ॉल्यूशन के लिए केवल मध्यवर्ती नैनोमीटर आकार के फ्लोरोसेंस को छोड़ दिया जाता है। पूरे नमूने को स्कैन करने से एक छवि बनती है। "STED का लाभ यह है कि यह एक पुश-बटन तकनीक है," हेल ने समझाया। "यह एक मानक कन्फोकल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप की तरह काम करता है।" यह हरे या पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन और रोडामाइन-व्युत्पन्न रंगों जैसे फ्लोरोफोरस का उपयोग करके जीवित कोशिकाओं की छवि भी बना सकता है। पैरामीट्रिक तुलना यद्यपि सभी सुपर-रिज़ॉल्यूशन तकनीक रिज़ॉल्यूशन के मामले में पारंपरिक प्रकाश माइक्रोस्कोपी से आगे निकल जाती हैं, लेकिन वे एक-दूसरे से भिन्न होती हैं। सिम लगभग 100 एनएम तक रिज़ॉल्यूशन को दोगुना कर देता है। PALM और STORM 15 एनएम लक्ष्यों को हल कर सकते हैं। हेल के अनुसार, STED जीवित कोशिकाओं में 30 एनएम और स्थिर कोशिकाओं में 15 एनएम का स्थानिक रिज़ॉल्यूशन प्रदान करता है। जब विशिष्ट अनुप्रयोगों की बात आती है, तो हमें सिग्नल-टू-शोर अनुपात पर भी विचार करना चाहिए। कुछ मामलों में, कम रिज़ॉल्यूशन लेकिन उच्च एसएनआर के परिणामस्वरूप विपरीत (उच्च रिज़ॉल्यूशन लेकिन कम एसएनआर) की तुलना में बेहतर छवि हो सकती है। छवि अधिग्रहण की गति भी बहुत महत्वपूर्ण है, खासकर जीवित कोशिकाओं के लिए। स्ट्रैसी ने कहा, "सभी सुपर-रिज़ॉल्यूशन तकनीक पारंपरिक प्रतिदीप्ति इमेजिंग तकनीकों की तुलना में धीमी हैं।" "PALM/STORM सबसे धीमा है, इसे एक छवि प्राप्त करने के लिए हजारों फ़्रेमों की आवश्यकता होती है, SIM को दर्जनों फ़्रेमों की आवश्यकता होती है, और STED एक स्कैनिंग तकनीक है, इसलिए अधिग्रहण की गति दृश्य के क्षेत्र के आकार पर निर्भर करती है।" जीवित कोशिकाओं या स्थिर इमेजिंग कोशिकाओं के अलावा, कुछ वैज्ञानिक यह भी समझना चाहते हैं कि वस्तुएँ कैसे चलती हैं। स्ट्रैसी केवल स्थिर छवियों को ही नहीं, बल्कि जीवित कोशिकाओं में जैविक प्रणालियों की गतिशीलता को समझने में रुचि रखती हैं। वह जीवित कोशिकाओं में गतिशीलता का विश्लेषण करने के लिए PALM को एकल कण ट्रैकिंग के साथ जोड़ता है। इस तरह, वह मार्कर अणुओं को सीधे ट्रैक कर सकता है क्योंकि वे अपना कार्य करते हैं। हालाँकि, उनका मानना है कि आणविक स्तर पर इन गतिशील प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए सिम उपयुक्त नहीं है, लेकिन इसकी तेज़ अधिग्रहण गति के कारण, यह संपूर्ण गुणसूत्रों जैसी बड़ी संरचनाओं की गतिशीलता का अवलोकन करने के लिए विशेष रूप से उपयुक्त है। नवीनतम परिणाम 2017 में, हेल्स टीम ने विज्ञान में MINFLUX सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोप की सूचना दी। हेल के अनुसार, यह सुपर-रिज़ॉल्यूशन विधि पहली बार 1 एनएम का स्थानिक रिज़ॉल्यूशन प्राप्त करती है। इसके अलावा, यह अन्य तरीकों की तुलना में जीवित कोशिकाओं में व्यक्तिगत अणुओं को कम से कम 100 गुना तेजी से ट्रैक कर सकता है। अन्य वैज्ञानिकों ने भी मिनफ्लक्स माइक्रोस्कोप की अत्यधिक प्रशंसा की। शेखटमैन ने कहा, "नए एप्लिकेशन और दृष्टिकोण लगातार विकसित किए जा रहे हैं, लेकिन दो प्रगतियां मेरे सामने हैं।" एक है मिनफ्लक्स। "यह बहुत सटीक आणविक स्थिति प्राप्त करने के लिए एक सरल विधि का उपयोग करता है।" दूसरे रोमांचक विकास के बारे में शेचटमैन ने स्टैनफोर्ड विश्वविद्यालय में वी मोर्नर और उनके सहयोगियों का उल्लेख किया। मोर्नर रसायन विज्ञान में 2014 के नोबेल पुरस्कार के प्राप्तकर्ता भी थे। विजेताओं में से एक. फ्लोरोसेंट एकल अणुओं के अनिसोट्रोपिक बिखरने के कारण होने वाली इमेजिंग रिज़ॉल्यूशन की सीमा को संबोधित करने के लिए, वैज्ञानिकों ने अणुओं के अभिविन्यास और स्थिति को निर्धारित करने के लिए विभिन्न उत्तेजना ध्रुवीकरणों का उपयोग किया। इसके अलावा, उन्होंने पुतली की नाजुक सतहें विकसित की हैं। ये तकनीकें संरचनाओं को स्थानीयकृत करने की क्षमता में सुधार करती हैं। फ्लोरोसेंट लेबल के बारे में कई सुपर-रिज़ॉल्यूशन अनुप्रयोगों में, लेबल वास्तव में मायने रखते हैं। कुछ कंपनियाँ ऐसी भी हैं जो संबंधित उत्पाद उपलब्ध कराती हैं। उदाहरण के लिए, जर्मनी की मिल्टेनी ने सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी रंगों के लिए कस्टम एंटीबॉडी संयुग्मन सेवाएं प्रदान करने के लिए स्टीफन हेल द्वारा स्थापित कंपनी एबेरियर के साथ मिलकर काम किया है। कई अन्य कंपनियाँ भी मिलान वाले मार्कर पेश करती हैं। क्रोमोटेक के विपणन अधिकारी क्रिस्टोफ एकर्ट कहते हैं, "हमारे नैनो-बूस्टर बहुत छोटे हैं, केवल 1.5 केडीए और अत्यधिक विशिष्ट हैं।" ये प्रोटीन हरे और लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी और आरएफपी) को बांधते हैं। वे अल्पाका एंटीबॉडी टुकड़ों से प्राप्त होते हैं, जिन्हें वीएचएच या नैनोबॉडी के रूप में जाना जाता है, जिनमें बैच-टू-बैच भिन्नता के बिना उत्कृष्ट बाध्यकारी गुण और स्थिर गुणवत्ता होती है। ये मार्कर SIM, PALM, STORM और STED सहित विभिन्न सुपर-रिज़ॉल्यूशन तकनीकों के लिए उपयुक्त हैं। यूनिवर्सिटी ऑफ मैरीलैंड स्कूल ऑफ मेडिसिन के सहायक प्रोफेसर ऐ-हुई तांग और उनके सहयोगियों ने तंत्रिका तंत्र में सूचना प्रसार का पता लगाने के लिए क्रोमोटेक के जीएफपी-बूस्टर और स्टॉर्म का उपयोग किया। उन्हें प्रीसिनेप्टिक और पोस्टसिनेप्टिक न्यूरॉन्स में आणविक नैनोक्लस्टर मिले, जिन्हें नैनोकॉलम कहा जाता है। वैज्ञानिकों का मानना है कि यह संरचना दर्शाती है कि केंद्रीय तंत्रिका तंत्र सिनैप्टिक दक्षता को बनाए रखने और विनियमित करने के लिए सरल सिद्धांतों को नियोजित करता है। सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के विभिन्न संस्करण और तरीकों की बढ़ती संख्या वैज्ञानिकों को जैविक रहस्यों में और भी गहराई तक ले जा रही है। दृश्य प्रकाश की विवर्तन सीमा को तोड़कर, जीवविज्ञानी कोशिकाओं की गतिविधियों की "बारीकी से निगरानी" भी कर सकते हैं।
